Frigivelse af prostaglandin hos søer ved traditionel og dyb inseminering samt bedækning

Hormonet oxytocin er bl.a. ansvarlig for sædtransporten hos søer i brunst gennem påvirkning af børens muskulatur, således at denne trækker sig sammen. En tidligere undersøgelse har vist, at der ved seksuel stimulation af søer til stående brust, ved kunstig sædoverføring (KS), udover oxytocin, også bliver udskilt store mænger prostaglandin (PGF_2alfa) [1]. Udskillelsen af PGF_2alfa sås alene ved KS og ikke ved bedækning. Det vides, at PGF_2alfa også påvirker børens sammentrækning af muskler, hvorved en krampetilstand i børmusklen kan opstå. I undersøgelser gennemført af Langendijk et al. [2], [3] blev det demonstreret, at en hæmning såvel som en øgning af børens sammentrækning påvirkede befrugtningen af æg negativt. Konklusionen var, at stimulation er godt, men for meget eller for lidt stimulation påvirker transporten af sæd negativt.

Ved dyb inseminering anvendes et almindeligt kateter, hvorigennem der føres et mindre kateter, således at sæden kan placeres i kroppen af børen. Herved undgås, at sæden kommer i kontakt med slimhinden i livmoderhalsen. Denne manglende kontakt kunne forhindre eller nedsætte udskillelsen af PGF_2alfa.

PGF_2alfa i blodbanen har en meget kort nedbrydningstid (minutter), hvor nedbrydningen primært sker ved blodets passage gennem lungerne. Målinger af PGF_2alfa må derfor baseres på måling af nedbrydningsproduktet 13,14-dihydro-15-keto- PGF_2alfa, også kaldet PGF_2alfa - metaboliten (PGFM).

Formålet med projektet var at undersøge, om stigningen i blodbanen af PGFM, som tidligere observeret ved traditionel KS, også indtræder ved anvendelse af dyb inseminering. Herudover at få afklaret, om en eventuel stigning også ville finde sted ved inseminering med råsæd og med ren sædfortynder (EDTA-fortynder).

Afprøvningen blev gennemført på forsøgsstation Grønhøj, hvor der blev udtaget blodprøver i perioden juli – august 2004. Blodprøverne blev analyseret for PGFM på Sveriges LantbruksUniversitet, Uppsala i perioden august - december 2004.

Afprøvningen blev gennemført efter tilladelse fra Dyreforsøgstilsynet (J.nr. 1999/561-234) til anvendelse af søer og Lægemiddelstyrelsen (J. nr. 2512-8435) til anvendelse af Stresnil^®. 

Forsøgsstation Grønhøj er en konventionel sobesætning på cirka 600 årssøer. Efter fravænning onsdag blev søerne indsat i løbeafdelingen. Der var fire ornestier i løbeafdelingen. Alle søer, der indgik i afprøvningen, havde mulighed for trynekontakt med en orne under deres ophold i løbeafdelingen. Der blev fravænnet 20 - 24 søer pr. uge med forventede løbedage mandag og tirsdag. Efter løbning forblev søerne i løbeafdelingen i 3 - 4 uger indtil erkendt drægtighed. Drægtighedsundersøgelser foregik ved brunstkontrol og drægtighedsskanning, hvorefter drægtige søer blev overflyttet til drægtighedsafdelingen. Søer, som indgik i afprøvningen, blev udvalgt tilfældigt, dog under hensyntagen til at begge ørevener var synlige. Antal tilstræbte søer i kontrol- og forsøgsgrupperne fremgår af tabel 1.

Tabel 1. Grupper med angivelse af behandling og antal søer pr. gruppe

Gruppe	Behandling	Antal søer, stk.
Kontrol	Traditionel inseminering med fortyndet sæd	12
Dyb	Dyb inseminering med fortyndet sæd	12
Bedæk	Bedækning med orne	12
Råsæd	Traditionel inseminering med råsæd	2
Fortynder	Traditionel inseminering med EDTA-fortynder	2

Der blev brunstkontrolleret to gange dagligt i løbet af weekenden, og søer, der udviste stående brunst, blev løbet mandag morgen og igen tirsdag morgen. Ved løbning blev soens alder, udtrykt som kuldnummer, registreret. Søerne blev enten bedækket eller insemineret med sæd eller fortynder leveret fra DanAvls KS-stationer.

Efter aktivering af ornen modtog alle søer stimulation til stående brunst som følger: Stød i flanken med knyttet hånd, greb og løften i lyskefolden, stød med knyttet hånd under kønsåbningen, krydsgreb, hvor soens kryds bearbejdedes med hænder og arme, samt rideprøve, hvor inseminøren sætter sig op på ryggen af soen og bevæger sædet frem og tilbage. Under inseminering sad inseminøren på soens ryg, mens der blev stimuleret omkring soens skulderområde med den ene fod/underben, samtidig med at den frie hånd blev anvendt til greb og løften i lyskefolden.

I kontrol-, råsæd- og fortynder-gruppen blev søerne insemineret ved hjælp af et almindeligt skumkateter placeret i den ydre del af livmoderhalsen. I dyb-gruppen blev anvendt et dyb insemineringskateter af typen ”Deep Goldenpig” (IMV Technologies, L´Aigle, Frankrig), der består af et almindeligt skumkateter med et inderrør (4 mm diameter) til placering af sæden i børkroppen. I alle tilfælde blev der insemineret med et dosisvolumen på 80 ml.

Blodprøver blev taget ved hjælp af et centralvenøst kateter (B. Braun, Cavafix Certo, kateter: 1,1×1,7 mm/16 Gauge, kanyle: 1,8×2,35 mm/14 Gauge, længde: 45 cm, 36 ml pr. minut), som blev lagt i søernes ørevener fredag efter fravænning. Ilægning blev foretaget efter sedation ved injektion af Stresnil® i. m. (Azaperone, Bayer, 0,5-1 ml pr. 20 kg), og ved anvendelse af trynebremse.

Der blev udtaget blodprøver to gange dagligt lørdag og søndag med et tidsinterval i dagtimerne på fem timer til bestemmelse af basalniveauet for PGFM for den enkelte so. Herudover blev der udtaget 18 blodprøver før, under og efter inseminering op til 55 minutter efter påbegyndt stimulation.

For at undgå tilstopning af kateter blev det skyllet og fyldt med saltvand og heparin (1 ml heparin pr. 100 ml isotonisk saltvand) efter blodprøveudtagning. Udtagning af blodprøver blev gjort med mindst mulig påvirkning af soen ved hjælp af påsætning af en 30 cm lang slange på kateteret.

Efter udtagning af 10 ml blod i en engangsplastsprøjte blev blodet overført til en 10 ml vacutainer indeholdende heparin tilsat 0,5 ml Trasylol® (Aprotinin, Bayer) (enzymhæmmer). Vacutainere med blod blev vendt for opblanding og prøverne blev herefter lagt på isbad i op til 30 minutter før centrifugering ved 3.200 rpm (rounds per minute) svarende til 1.000 G (G står for gravitas s. centrifugalkraft) i 10 minutter ved 4 °C. Umiddelbart efter centrifugering blev blodplasma fra hver prøve afpippeteret med en engangsplastpipette og overført til præparatrør af polypropylen, hvorefter de blev opbevaret ved ÷20 °C. Maksimum 14 dage herefter blev prøverne overført til ÷80 °C, hvor de blev opbevaret indtil analyse.

Plasma blev analyseret for indholdet af PGFM ved hjælp af Radio Immuno Assay (RIA) som beskrevet af Granström og Kindahl [4]. Intra-assay variationskoefficienten var opgivet værende mellem 3,4 og 7,5 procent, mens inter-assay variationskoefficienten var 14 procent. Detektionsgrænsen for PGFM var opgivet til 100 pmol/liter.

Hver inseminering blev inddelt i følgende perioder med tiden 0 som påbegyndelse af stimulation: -10–0, 0-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 og 50-60. Gennemsnitsværdier for PGFM i de angivne tidsintervaller blev anvendt. Udover beskrivende statistik blev proceduren PROC MIXED i statistikprogrammet SAS^® anvendt [5].

I alt blev 28 søer insemineret traditionelt eller dybt 39 gange, mens 11 søer blev bedækket 15 gange. Til bedækning blev anvendt to forskellige orner, dog således at dersom en so blev bedækket flere gange, blev samme orne anvendt. Fordelingen på grupper er vist i tabel 2.

Alder udtrykt som gennemsnits antal kuld pr. so var 3,67 med en spredning på 1,69. Der var ingen forskel i soalder mellem grupperne.

Tabel 2. Grupper med angivelse af antal søer og antal insemineringer eller bedækninger

Gruppe	Antal søer, stk.	Antal insemineringer eller bedækninger, stk.
Kontrol	13	18
Dyb	11	14
Bedæk	11	15
Råsæd	2	3
Fortynder	2	4

Årsagen til forskellen mellem det tilstræbte antal søer pr. gruppe (tabel 1) og det reelle antal søer (tabel 2) var, at ikke alle søer var i brunst til 2. inseminering eller bedækning, og at ikke alle søer kunne insemineres dybt. De søer, som ikke kunne insemineres dybt, blev insemineret traditionelt og indgik derfor i kontrolgruppen.

De opnåede PGFM værdier fordelt på tidsintervaller og grupper er angivet i tabel 3.

Tabel 3. PGFM-værdier i plasma (pmol/l), som gennemsnitsværdi, fordelt på tidsintervaller (minutter) hos søer før, under og efter stimulation ± SD. I alt 39 søer

Gruppe	Kontrol	Dyb	Bedæk	Råsæd	Fortynder
Antal insemineringer eller bedækninger, stk.	18	14	15	3	4
Basal koncentration (lørdag og søndag)	188,7 ± 79,8	162,7 ± 78,2	173,8 ± 67,3	215,6 ± 61,9	162,8 ± 84,0
-10 – 0	226,8 ± 113,5	193,1 ± 80,1	208,3 ± 73,6	190,8± 54,7	141,4 ± 41,5
0 – 10	232,7 ± 102,3	229,2 ± 90,8	288,2 ± 92,8	215,0 ± 37,8	155,0 ± 50,0
10 – 20	316,0 ± 160,2a	318,5 ± 181,4a	292,5 ± 108,0b	200,5 ± 31,5b	322,4 ± 207,0a
20 – 30	500,8 ± 326,5a	440,2 ± 233,3a	249,0 ± 85,8b	212,7 ± 42,0b	409,9 ± 237,1a
30 – 40	527,0 ± 284,3a	432,1 ± 244,7a	224,9 ± 69,1b	263,2 ± 87,6b	352,0 ± 137,0a
40 – 50	555,6 ± 297,0a	489,2 ± 297,1a	222,8 ± 89,8b	383,3± 152,8a	396,1 ± 133,7a
50 – 60	558,8 ± 281,2a	475,3 ± 266,1a	240,5 ± 98,2b	396,3 ± 207,5a	420,3 ± 196,8a
60 – 70	-*	435,5 ± 201,2	-*	-*	-*

* a,b:

Ingen blodprøvning Forskelligt bogstav indenfor række angiver statistisk sikker forskel (p < 0,05)

Basalniveauet indenfor hver gruppe er bestemt som gennemsnittet af alle målinger af PGFM foretaget i den forudgående weekend. PGFM i de angivne tidsintervaller er bestemt som gennemsnittet af alle målinger af PGFM foretaget i de respektive tidsperioder. Generelt skal det nævnes, at der er en stor usikkerhed på de fundne værdier udtrykt ved den relative store spredning (SD).

Som det ses af tabel 3, var der ingen forskel i basalniveauerne af PFGM hos søer i de fem grupper. Overordnet var basalniveauet 179,9 pmol pr. liter plasma med en spredning på 106,1, for weekendprøverne. Dette basalniveau er sammenligneligt med de fundne PGFM-værdier fra blodprøver undersøgt før påbegyndelse af stimulationen (tidsintervallet -10 – 0).

For tidsintervallet 0 – 10 minutter ses en numerisk stigning i PFGM-værdi for alle grupper, sammenholdt med værdierne før stimulering. Stigningen er dog ikke signifikant. I intervallet 10 – 20 minutter ses en forsat stigning for kontrolgruppen samt dyb- og fortynder-grupperne. Stigningen er signifikant forskellig fra bedæk- og  råsæd-gruppen. Denne forskel holder sig også i tidsintervallerne 20 – 30 og 30 – 40 minutter. Herefter begynder råsæd-gruppen at stige til et niveau, som ikke er forskellig fra kontrolgruppen, mens bedæk-gruppen holder sig på et lavt PGFM-niveau.

Sammenholdes data fra denne afprøvning med tidligere målinger af PGFM hos danske søer [1] ses enslydende resultater. I den tidligere afprøvning steg PGFM-niveauet for de traditionelt inseminerede søer dog til mellem 800 – 1.000 pmol pr. liter plasma cirka 30 minutter efter påbegyndelse af stimulation. Ved bedækning var der ingen stigning i PGFM. Basalniveauet af PGFM var det samme for de to afprøvninger.

For en grafisk fremstilling af de fundne PFGM-værdier henvises til figur 1.

Figur 1. Indhold af PGFM (pmol/liter plasma) før, under og efter stimulation (t = 0), fordelt på grupper

Resultaterne viser, at uanset insemineringsmetode (traditionel eller dyb) fås en stigning i PGFM, når der insemineres med almindeligt fortyndet sæd. Da der ved dyb inseminering ikke er kontakt mellem den fortyndede sæd og slimhinden i børhalsen, må den fundne stigning i PGFM højst sandsynligt tilskrives den fortyndede sæds kontakt med slimhinden i kroppen af børen. Dette underbygges også af, at det er i slimhinden i børkroppen (under soens brunst), at den største produktion af prostaglandin finder sted [6]. Samme stigning i PGFM ses også, når der insemineres traditionelt med ren EDTA-fortynder.

Ved bedækning ses ingen stigning i PGFM. Sammenholdes dette med gruppen af søer som blev traditionelt insemineret med råsæd, hvilket gav en forsinket stigning i PGFM (forsinket cirka 30 minutter), tyder det på, at råsæd indeholder et stof eller stoffer, som kan forhindre dannelsen eller udskillelsen af prostaglandin fra slimhinden i børkroppen.

Udover oxytocin, som via sin indvirken på børens muskler er med til at forbedre sædtransporten ved KS, kan eventuelt tilstedeværende PGF_2alfa også indvirke på muskulaturen. Undersøgelser har vist, at tilstedeværelse af store mængde af begge stoffer kan medføre en krampetilstand i børens muskler og dermed påvirke sædtransporten negativt.

Søer, som enten blev insemineret traditionelt, dybt eller bedækket, fik taget blodprøver før, under og efter inseminering eller bedækning. Blodprøverne blev analyseret for PGF_2alfa – metaboliten, PGFM. Blodprøveanalyserne viste, at ved traditionel og dyb inseminering steg indholdet af PGFM i blodbanen i tidsintervallet 10 – 20 minutter efter påbegyndt stimulation. PGFM-niveauet forblev højt i optil 60 minutter efter påbegyndt stimulation. For de søer, som blev bedækket, sås ingen stigning. Resultaterne er i tråd med en tidligere undersøgelse under Landsudvalget for Svin, som viste samme tendens [1]. Her blev niveauet af PGFM i blodbanen sammenlignet for søer som blev traditionelt insemineret med søer som blev bedækket. Ved insemineringen sås en stigning i PGFM, mens der hos de bedækkede søer ikke sås en stigning.

For yderligere at afdække årsagen til den fundne stigning blev to søer insemineret traditionelt enten med råsæd eller med ren EDTA-fortynder. For søer insemineret med EDTA-fortynder sås den samme stigning i PGFM som for søer insemineret med almindelig fortyndet sæd. Men for søer insemineret med råsæd sås ingen umiddelbar stigning i PGFM. Stigningen i PGFM hos disse søer blev ”forsinket”, det vil sige at stigningen først kom i tidsintervallet 40 – 50 minutter efter påbegyndt stimulation.

Konklusionen på denne afprøvning er, at den øgede udskillelse af PGF_2alfa til blodbanen sker, når den fortyndede sæddosis kommer i kontakt med slimhinden i børen. Hvilke indholdsstoffer i EDTA-fortynderen, som er ansvarlig for denne øgede udskillelse af PGF_2alfa, vides ikke. Endvidere må det konkluderes, at ufortyndet ornesæd ikke medfører en stigning i udskillelsen af PGF_2alfa ved kontakt med slimhinden i børen. Om denne effekt skyldes en hæmning i dannelsen af PGF_2alfa eller en hæmning i udskillelsen af PGF_2alfa fra slimhinden i børen, vides endnu ikke.

Yderligere undersøgelser er påkrævet til afklaring af, hvorfor færdigfortyndet sæd bevirker en stigning i PGF_2alfa og ikke mindst, hvordan dette kan undgås.

[1]	Madsen, M.T.; Larsen, M.; Mathiasen, J.; Kindahl, H.; Einarsson, S.; Madej A.: (2002): Plasma levels of oxytocin and PGF2alfa   metabolite during AI and mating in multiparous sows. Reprod. Dom. Anim., 37, p. 242
[2]	Langendijk, P.; Bouwman, E.G.; Soede, N.M.; Taverne, A.M.; Kemp, B.: (2002): Myometrial activity around estrus in sows: spontaneous activity and effects of estrogens, cloprostenol, seminal plasma and clenbuterol. Theriogenology, 57, pp. 1563-1577
[3]	Langendijk, P.; Bouwman, E.G.; Kidson, A.; Kirkwood, R.N., Soede, N.M.; Kemp, B.: (2002): Role of myometrial activity in sperm transport through the genital tract and in fertilization in sows. Reproduction, 122, pp. 289-296
[4]	Granström, E.; Kindahl, H.: (1982): Radioimmunoassay of the major plasma metabolite of PGF2alfa, 15-keto-13, 14-dihydro- PGF2alfa, Methods in Enzymology, 86, pp. 302-399
[5]	SAS® Institute Inc.: (1997): Cary, NC, USA
[6]	Willenburg, K.L.; Knox, V.; Kirkwood, R.N.: (2004): Effect of oestrogen formulation and its site of deposition on serum PGFM concentrations, uterine contractility, and time of ovulation in artificially inseminated weaned sows. Animal Reproduction Science, 80, pp. 147-156

Deltagere:
Veterinærstuderende Morten Nøhr Vibjerg, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole
Ansatte på forsøgsstation Grønhøj, Landsudvalget for Svin
Konsulent Johnny Mathiasen, Landsudvalget for Svin
Konsulent Anne Marie Hedeboe, Landsudvalget for Svin
Statistiker Mai Britt Nielsen, Landsudvalget for Svin

Afprøvning: 789