Ny antibiotikakombination som tilsætning til ornesæd

Sammendrag

En ny antibiotikakombination bestående af 100 mikrogram Gentamycin og 100 mikrogram Amoxicillin per ml færdigfortyndet sæd, er blevet undersøgt som tilsætning til EDTA-fortynderen til fortynding af ornesæd. Afprøvningen bestod dels af en laboratorieundersøgelse samt afprøvning i produktionsbesætninger.

En bakteriologisk undersøgelse (bakteriedrab og resistens) af kombinationen af Gentamycin og Amoxicillin viste sig effektiv overfor mulige forekommende bakterier isoleret fra ornesæd, samt fra ornens forhud. Herudover var antibiotikakombinationen effektiv overfor Salmonella typhimurium, DT104.

Undersøgelser for negativ effekt på sædcellernes bevægelighed samt på sædcellernes akrosomalkappe af antibiotikakombinationen blev sammenlignet med en antibiotikakombination bestående af Penicillin, Streptomycin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen) samt Neomycinsulfat. Der sås ingen forskel mellem grupperne.

En besætningsafprøvning med otte besætninger hvor samme ejakulat blev fortyndet i EDTA-fortynderen indeholdende enten EU-cocktailen eller en kombination af Gentamycin og Amoxicillin, omfattende ca.1.400 kuld per gruppe, viste ingen statistisk sikker forskel i faringsprocent eller totalfødte grise per kuld. Tilsvarende blev der fra besætningerne ikke berettet om negativ effekt (”adverse effect”) ved anvendelse af antibiotikakombinationen i forsøgsgruppen.

Det kan konkluderes, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin anvendt i EDTA-fortynderen til fortynding af ornesæd kan forhindrer overførsel af mulige forekommende bakterier inklusiv Salmonella typhimurium, DT104. Den pt. anvendte EU-cocktail dræber ikke Salmonella typhimurium, DT104. Endvidere ses en neutral effekt på sædcellernes bevægelighed, akrosomalkappe samt på reproduktionsresultater udtrykt som faringsprocent og totalfødte grise per kuld.

Det må derfor anbefales at anvende en kombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til ornesæd i stedet for den pt. anvendte EU-cocktail eller den tidligere anvendte Neomycinsulfat. Anbefalingen gælder alene salg af sæd i Danmark, da en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke med sikkerhed virker overfor Mykoplasma eller Leptospirer som krævet af myndighederne ved salg af sæd uden for landets grænser.

Der er ansøgt om tilladelse til anvendelse af den nye antibiotikakombination, men tilladelse er endnu ikke givet af Fødevaredirektoratet.

Baggrund

I Danmark sælges mere end 2.600.000 sæddoser fra Danavls KS-stationer om året. For at nedbringe risikoen for overførsel af potentielt sygdomsfremkaldende bakterier tilsættes antibiotika til sæden. I ”Veterinærdirektoratets bekendtgørelse om ornesæd nr. 598 af 29. juni 1992” er krav til antibiotikumtilsætning beskrevet. Heri fastslås det, at sæd til salg i Danmark skal tilsættes Neomycin, en antibiotikakombination af Penicillin, Streptomycin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen) eller en antibiotikakombination med mindst tilsvarende virkning.

Indtil april 1996 blev der til færdigfortyndet sæd fra Danavls KS-stationer anvendt Neomycin, men efter en bakteriologisk undersøgelse af 50 ejakulater blev der fundet en delvis forurening af den færdigfortyndede sæd. På baggrund af dette fund blev det besluttet, at skifte antibiotika til den i bekendtgørelsen nævnte EU-cocktail. Samtidig med dette skift blev der påbegyndt en undersøgelse af mulige nye antibiotika, som med fordel kunne anvendes som tilsætning til ornesæd.

Det var et krav, at den nye antibiotika-cocktail

I samarbejde med Institut for Farmakologi og Patobiologi, Den Kongelige Veterinær- og Landbohøjskole, Frederiksberg (KVL), blev to antibiotika fundet som værende mulige kandidater. Disse var Gentamycin og Amoxicillin og i kombination opfylder de, de stillede krav til mulige antibiotika-kandidater.

Formålet med denne afprøvning var at undersøge en antibiotikakombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til sæd overfor alment forekommende bakterier i ornesæd, på sædskadende effekt udtrykt som sædcellernes bevægelighed og akrosomalkappe, samt på reproduktionsresultaterne i produktionsbesætninger.

Afprøvningen blev gennemført med delvis økonomisk støtte fra Dan-Avl’s KS-stationer.

Materialeog metode

Bakteriologi, drabseffekt og resistens

På baggrund af et litteraturstudium samt mikrobiologisk isolation af alment forekommende bakterier i sæd og i svaberprøver fra udposningen af ornens forhud, blev relevante bakteriearter inklusive Salmonella typhimurium, DT104, undersøgt af Statens Veterinære Serumlaboratorium, København (SVS). SVS undersøgte den bakteriedræbende effekt såvel som resistensmønsteret af bakterierne overfor Amoxicillin og Gentamycin.

Hver enkelt stamme under hver bakterieart blev dyrket i 24 timer ved 37°C i Müller-Hinton bouillon (Merck). Dernæst blev turbiditeten indstillet til 0,5 på McFarland-skalaen, hvilket svarer til en koncentration af bakterier på 1,5 x 10exp8 kolonidannende enheder (CFU) per ml. Fra denne opløsning anvendtes en koncentration på 1 x 10exp5 CFU i et total volumen på 10 ml EDTA-fortynder (ethylen-diamin-tetra-acetat) til de videre undersøgelser.

Alle stammer under hver bakterieart blev inkuberet i 24 timer ved 37°C med Amoxicillin, Gentamycin, en kombination af Amoxicillin og Gentamycin samt EU-cocktailen (kontrolgruppe). Koncentrationen af de enkelt antibiotika fremgår af tabel 1. Efter inkubation blev foretaget udstrygning af 0,5 ml suspension på overfladen af 2 blodagarplader. Pladerne blev inkuberet i 24 timer ved 37°C og derefter observeret for vækst. Som kontrol blev anvendt bakteriekultur uden antibiotika samt EDTA-fortynderen alene.

Resistensmønster for alle stammer under hver bakterieart blev bestemt ved anvendelse af Rosco Neo-Sensitabs efter standardmetode anbefalet af leverandøren. Tabletter med de enkelte antibiotika eller antibiotikakombinationer blev placeret på blodagarplader med vækst af de relevante bakteriestammer og inkuberet i 24 timer ved 37°C. Derefter blev hæmningszonerne bestemt og resistensmønsteret fastlagt.

Tabel 1. Koncentration af antibiotika anvendt i bakteriedrabs- og resistensforsøg med angivelse af leverandør

Bevægeligheds og akrosomalkappe-undersøgelser

I samarbejde med Hatting-KS, Ringsted afdelingen, blev sædcellernes bevægelighed bestemt og sædcellernes akrosomalkappe vurderet, henover tid.

Undersøgelsen indbefattede EU-cocktailen (kontrolgruppe 1) og antibiotikakombinationen af Gentamycin og Amoxicillin, i koncentrationer som angivet i tabel 1. Herudover blev sædcellerne også undersøgt overfor Neomycin i en koncentration på 1 mg Neomycinsulfat per ml færdigfortyndet sæd (kontrolgruppe 2). Neomycinsulfaten blev leveret af Skanderborg Apotek. Neomycin blev inddraget i undersøgelserne, da antibiotikumet tidligere har været anvendt som tilsætning til ornesæd i Danmark. I alle tre gruppe blev sæd fra samme ejakulat anvendt. Den færdigfortyndede sæd blev opbevaret ved 16-18°C. Figur 1 angiver forløbet af bevægeligheds- og akrosomalkappeundersøgelser herover tid.

Bevægeligheden af sædcellerne blev bestemt efter reaktivering og ved anvendelse af mikroskopi ved 200 ganges forstørrelse, som det rutinemæssigt bliver udført på Danavls KS-stationer, i henhold til Reglerne (1997) (1).

Undersøgelser for intakt akrosomalkappe på råsæd blev udført umiddelbart efter opsamling ved at blande 50 µl råsæd med 250 µl formolcitrat. Indholdet i formolcitraten fremgår af tabel 2. Selve fikseringen blev foretaget ved at overføre en dråbe af blandingen til et objektglas, som derefter blev forsynet med et dækglas. Vurderingen af præparatet udførtes ved at undersøge akrosomalkappen på minimum 100 sædceller ved 1.000 ganges forstørrelse (olieimmersion). Vurderingen af akrosomalkappen blev udført ad modum Pursel et al. (1972) (2). De morfologiske fund på akrosomalkappen opdeles i intakt apikal rand og andre. Sidstnævnte defineres som ødelagt apikal rand, manglende apikal rand og løs akrosomalkappe. Sædceller, som ikke kunne karakteriseres som værende med normal eller unormal akrosomalkappe, blev defineret som intermediære. Resultatet blev opgjort som procent sædceller med intakt apikal rand (PIA).

Undersøgelser for intakt akrosomalkappe på færdigfortyndet sæd blev udført ved at blande 125 µl sæd med 250 µl formolcitrat. Det videre forløb er tilsvarende som beskrevet for råsæd.

Figur 1. Undersøgelsesprogram af sædcellernes bevægelighed og procent sædceller med intakt akrosomalkappe herover tid

Tabel 2. Indholdsstoffer i formolcitrat anvendt til undersøgelser af sædcellernes akrosomalkappe

Besætningsafprøvning

Afprøvningen blev gennemført med sæd fra Hatting-KS, Horsens afdelingen, leveret til otte produktionsbesætninger i perioden april 1998 - juni 2000.

Kvalitetsgodkendt blandingssæd fra 5-10 Durocorner blev delt i to og fortyndet i EDTA-fortynder indeholdende EU-cocktailen (kontrol) eller en antibiotikakombination bestående af Gentamycin og Amoxicillin. Gruppe, antibiotikum, koncentration og leverandør fremgår af tabel 3.

Tabel 3. Besætningsafprøvning. Gruppe, antibiotika og koncentration i færdigfortyndet sæd

Sæddoserne blev mærket med en kode for gruppenummer for at blinde forsøget overfor besætningsejerne og udsendtes som en fast leverance hver mandag til besætningerne. Den udsendte sæd skulle anvendes samme og efterfølgende dag, for at de inseminerede søer kunne indgå i forsøget.

I besætningerne blev insemineringerne foretaget som renløbninger. Det vil sige, at de to insemineringer per so blev foretaget med sæd med samme kode. Alene søer, som blev insemineret to gange med ca. 24 timer mellem 1. og 2. insemination, indgik i afprøvningen. Der indgik ikke omløbere i afprøvningen. Dersom gylte indgik i afprøvningen tilstræbtes det, at det samme antal gylte indgik i hver af grupperne.

Resultat og diskussion

Bakteriologi, drabseffekt og resistens

Udfra den internationale litteratur samt konkrete bakteriefund fra sæd og svaberprøver fra forhuden af danske orne blev undersøgt et udsnit af bakterier, som ville kunne tænkes at forekomme i sæden. De undersøgte bakteriearter er angivet i tabel 4.

Tabel 4. Den mulige bakterielle population som kan isoleres i sæd fra danske orner

De fundne bakteriearter blev herefter rendyrket og bestemt efter stamme, hvorefter de enkelte bakteriestammer blev undersøgt overfor EU-cocktailen, Amoxicillin og Gentamycin. Sidstnævnte to antibiotika blev anvendt både hver for sig og i kombination. I undersøgelsen blev Salmonella typhimurium, DT104, også inkluderet, selvom denne ikke var fundet som mulig tilstedeværende i sæden. Undersøgelsen inkluderede udover en bestemmelse af den enkelte bakteriestammes resistens også en måling af effekten af antibiotika på de enkelte bakterier dvs., drab eller ikke-drab. Resistensmønsteret er angivet i tabel 5 og 6, mens drabseffekten er angivet i figur 2.

Tabel 5. Resistensmønster for bakteriestammer, som mulige fund i ornesæd, samt Salmonella typhimurium overfor en kombination af Streptomycin, Penicillin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen)

Tabel 6. Resistensmønster for bakteriestammer, som mulige fund i ornesæd, samt Salmonella typhimurium overfor Gentamycin og Amoxicillin alene og i kombination

Som det ses af tabel 5 var 11 ud af 17 bakteriestammer følsomme overfor EU-cocktailen, mens seks bakteriestammer var resistente i mere eller mindre udtalt grad. Ved anvendelse af Gentamycin og Amoxicillin i kombination (tabel 6) var samtlige undersøgte stammer følsomme, inklusiv Salmonella typhimurium, DT104. De samme forhold gjorde sig gældende ved bakteriedrabsforsøget vist i figur 2.

1)  En stamme viste afvigende effekt ved brug af EU-cocktailen

2)  Indeholder data fra både Serratia og Providencia

Figur 2. Bakteriedrabseffekt af EU-cocktailen og en kombination af Gentamycin og Amoxicillin på bakteriestammer som mulige fund i ornesæd, samt Salmonella typhimurium, DT104

Årsagen til den bedre effekt af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin i forhold til EU-cocktailen skal findes i stoffernes virkemåde overfor bakterierne.

Gentamycinsulfat, tilhører gruppen af aminoglykosider, og er en blanding af tre tæt relaterede antibakterielle stoffer. Gentamycin virker via hæmning af et bakterielt protein inde i bakterien, som bevirker, at bakterien ikke kan dele sig. Gentamycin er aktiv overfor Enterobacter aerogenes, E. coli og Klebsiella pneumoniae, indol-positive og indol-negative arter af Proteus og Pseudomonas aeruginosa, Serratia og mange arter af Salmonella og Shigella. Endvidere virker stoffet overfor Vibrio coli og Brachyspira hyodysenteria.

Amoxicillin (alfa-amino-p-hydroxy-benzyl-penicillin) virker bakteriedræbende ved at destabilisere bakteriernes kappe. Amoxicillin er aktiv overfor de samme bakterier som Penicillin G samtidig med effekt på gram-negative bakterier herunder mange entero-patogene arter.

De to stoffer har i kombination en synergistisk effekt, hvilket vil sige, at de virker mere effektivt sammen end alene, hvorved risikoen for resistens minimeres.

Hverken Gentamycin eller Amoxicillin har med sikkerhed vist effekt overfor Mykoplasma eller Leptospirer. En effekt overfor disse to bakterier kræves ved salg af sæd udenfor Danmarks grænser i henhold til ”Veterinærdirektoratets bekendtgørelse om ornesæd nr. 598 af 29. juni 1992”. En anvendelse af antibiotikakombinationen er derfor alene tænkt til anvendelse i sæd til salg i Danmark.

Dog skal det nævnes, at Mykoplasma i sæd aldrig er bevist som værende årsag til smitte via kunstig sædoverføring (3).

Undersøgelser for bevægelighed blev udført 24, 72 og 96 timer efter opsamling og sammenlignet med bevægeligheden ved opsamling. Data er derfor udtrykt som et fald i bevægelighed henover tid for samme ejakulat fortyndet i EDTA-fortynderen med EU-cocktail, Neomycinsulfat og en kombination af Gentamycin og Amoxicillin. Gennemsnitsfald i bevægelighed samt standardafvigelse er vist i tabel 7, mens resultater fra de enkelte ejakulater er vist i appendiks 1.

Tabel 7. Gennemsnitsfald i procent og standardafvigelse i bevægelighed 0-24, 0-72 og 0-96 timer efter opsamling

Tabel 7 skal læses som, jo mindre talværdi, jo mindre fald, og dermed jo bedre bevægelighed. Sammenlignes tallene lodret indenfor de enkelte tidsintervaller ses det, at der ikke er forskel mellem forsøgsgruppen og de to kontrolgrupper. Dette betyder, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke hæmmer bevægeligheden af sædceller sammenlignet med anvendelse af EU-cocktailen eller Neomycin.

I appendiks 1 er enkelte værdier for faldet i bevægelighed angivet som negative tal, hvilket vil sige, at tallet for bevægelighed er blevet vurderet højere efter 24, 72 eller 96 timer end ved opsamling. Dette fænomen er sjældent realistisk, men alene et udtryk for, at metoden til bevægelighedsundersøgelse er delvis subjektiv.

Undersøgelse for intakt sædcelle akrosomalkappe blev udført 72 timer efter opsamling og sammenlignet med en bedømmelse ved opsamling. Resultatet er udtrykt som et fald i intakt akrosomalkappe henover tid for samme ejakulat fortyndet i EDTA-fortynderen med EU-cocktail, Neomycinsulfat og en kombination af Gentamycin og Amoxicillin. Gennemsnitsfald i procent sædceller med intakt akrosomalkappe, samt standardafvigelse er vist i tabel 8, mens resultater fra de enkelte ejakulater er vist i appendiks 2.

Tabel 8 skal læses, som jo mindre talværdi, jo mindre fald, og dermed en højere procentdel sædceller med intakt akrosomalkappe i tidsintervallet 0-72 timer. Der ses ikke forskel mellem forsøgsgruppen og de to kontrolgrupper. Dette betyder, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke udviser større akrosomalkappeskadende effekt end EU-cocktailen eller Neomycin.

Tabel 8. Gennemsnitsfald og standardafvigelse i procent sædceller med intakt, akrosomalkappe 0-72 efter opsamling

Besætningsafprøvning

Tabel 9 viser faringsprocent og totalfødte grise per kuld som et gennemsnit for de otte involverede besætninger. Data for de enkelte besætninger kunne adderes, da en statistisk analyse viste, at der ikke var en vekselvirkning mellem besætninger. Faringsprocent og totalfødte grise per kuld for den enkelte besætning er angivet i appendiks 3.

Tabel 9. Antal søer i forsøg, gennemsnit af faringsprocent og totalfødte grise per kuld samt standardafvigelser for 8 besætninger

Forsøget var planlagt til at omfatte 1.400 kuld per gruppe. Med denne kuldstørrelse vil det være muligt at kunne påvise en forskel i faringsprocent på 2,41, samt en forskel i totalfødte grise per kuld på 0,24 ved en spredning på kuldstørrelsen på 3,2. Tabel 9 viser, at forsøgsgruppen ikke giver en statistisk sikker forskel i faringsprocent eller totalfødte grise per kuld sammenlignet med kontrolgruppen. Det betyder, at kombinationen af Gentamycin og Amoxicillin ikke påvirker faringsprocent eller totalfødte grise per kuld negativt, når der sammenlignes med EU-cocktailen. Endvidere viser data, at gylte indgår med en ligelig fordeling inden for hver gruppe og hver besætning.

Der blev ikke under hele forsøgsperioden i de otte besætninger berettet om negativ effekt (”adverse effect”) ved anvendelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin i EDTA-fortynderen som tilsætning til ornesæd.

Konklusion

Anvendelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til ornesæd i EDTA-fortynder, har vist sig effektiv overfor mulige forekommende bakterier isoleret fra ornesæd, samt fra ornens forhud. Herudover har antibiotikakombinationen vist sig effektiv overfor Salmonella typhimurium, DT104. Antibiotikakombinationen er ikke med sikkerhed effektiv overfor Mykoplasma eller Leptospirer, som kræves af myndighederne ved salg af sæd uden for Danmark.

En undersøgelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin på sædcellebevægelighed 24, 72 og 96 timer efter opsamling, samt en undersøgelse for sædskadende effekt udtrykt som beskadigelse af akrosomalkappen på sædcellerne 72 timer efter opsamling, har ikke vist en forskel ved sammenligning med den pt. anvendte EU-cocktail eller den tidligere anvendte Neomycinsulfat.

I en besætningsafprøvning med otte besætninger og ca. 1.400 kuld per gruppe blev en kombination af Gentamycin og Amoxicillin afprøvet overfor EU-cocktailen. Der fandtes ingen statistisk sikker forskel i faringsprocent eller totalfødte grise per kuld. Endvidere blev der ikke berettet om negativ effekt (”adverse effect”) ved anvendelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin i EDTA-fortynderen.

Da Gentamycin og Amoxicillin har synergistisk effekt, dvs., at de i kombination virker mere effektivt end alene, betyder en anvendelse af disse to stoffer samtidigt en minimering af risikoen for udvikling af resistens mod et eller begge stoffer.

Det kan konkluderes, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin anvendt i EDTA-fortynderen til fortynding af ornesæd forhindrer overførsel af mulige forekomne bakterier inklusiv Salmonella typhimurium, DT104. Endvidere ses en neutral effekt på sædcellernes bevægelighed, akrosomalkappe, samt reproduktionsresultater udtrykt som faringsprocent og totalfødte grise per kuld.

Det må derfor anbefales at anvende en kombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til ornesæd i stedet for den pt. anvendte EU-cocktail eller den tidligere anvendte Neomycinsulfat. Anbefalingen gælder alene salg af sæd i Danmark, da en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke med sikkerhed virker overfor Mykoplasma eller Leptospirer, som krævet af myndighederne ved salg af sæd uden for landets grænser.

Der er ansøgt om tilladelse til anvendelse af den nye antibiotikakombination, men tilladelse er endnu ikke givet af Fødevaredirektoratet.

Referencer

Afprøvningen er udført i samarbejde med:

Fagdyrlæge vedrørende svin, Lisbeth Vesterager Borge

Landbrugstekniker Hanne Nissen, Landsudvalget for Svin.

Laboratorieleder Susanne Christensen, Hatting-KS, Horsens afdelingen

Laboratorietekniker Hanne Erez, Hatting-KS, Ringsted afdelingen

Appendiks 1 - Enkeltdata fra bevægelighedsundersøgelsen

Motilitetsundersøgelse: I = EU-cocktail, II= neomycin og III = gentamycin/amoxicillin I = EU-cocktail, II = Neomycinsulfat og III = Gentamycin/Amoxicillin

Appendiks 2 - Enkeltdata fra akrosomalkappeundersøgelse

Akrosomalbedømmelse: I = EU-cocktail, II = Neomycinsulfat og III = gentamycin/amoxicillin og III = Gentamycin/Amoxicillin