Nyt program til mikrobiologisk kontrol af færdigfortyndede sæddoser

Bakteriologiske undersøgelser af færdigfortyndet ornesæd tilsat antibiotika har vist, at den færdigfortyndede sæd ikke er steril. Det er ikke noget krav, at færdigfortyndet sæd skal være steril (1), men i sæd, der ikke er steril, vil kvaliteten af sæden kunne være forringet (2). Desuden vil forurenet sæd kunne udgøre en risiko ved spredning af potentielt sygdomsfremkaldende mikroorganismer eller spredning af mikroorganismer med antibiotikaresistens.

Med udgangspunkt i ovenstående blev det besluttet at finde de kritiske punkter fra ejakulat til færdigfortyndet sæddose i processen på KS-stationerne, hvor mikroorganismer kunne tænkes at forurene færdigvaren. Som model blev HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points s. risikoanalyse af kritiske kontrolpunkter) anvendt (3).

Formålet med afprøvningen var, at begrænse antallet af mikroorganismer i de færdigfortyndede sæddoser, for derved at forbedre kvaliteten udtrykt som holdbarhed og befrugtningsevne. En reduktion af tilstedeværende mikroorganismer vil samtidig medvirke til at mindske risikoen for spredning af potentielt sygdomsfremkaldende mikroorganismer, samt resistente mikroorganismer med sæden.

Materiale og metode

Afprøvningen blev gennemført på samtlige Dan-Avls KS-stationer og foregik i perioden august 1997 til januar 2001.

Som metode blev anvendt HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points s. risikoanalyse af kritiske kontrolpunkter), et program som er designet til at finde de kritiske punkter i en proces og overvåge disse (3).

Metoden bygger på fire grundlæggende principper;

• Identifikation af mulige risici fra ejakulat til færdigfortyndet sæddose
• Identifikation af de punkter, hvor risikoen kan elimineres eller reduceres
• Etablering af kritiske grænser, der skal respekteres for at sikre, at hvert punkt er under kontrol, samt udarbejdelse af et overvågningssystem
• Etablering af korrigerende handlinger, når overvågningen indikerer, at et punkt ikke er under kontrol.

Afprøvningen blev opdelt i;

• en undersøgelse af de kritiske punkter, for mulig forurening med mikroorganismer fra ejakulat til færdigfortyndet sæd i arbejdsgangen på KS-stationerne
• forbedring af arbejdsprocedurer ved de fundne kritiske punkter, samt fastlæggelse af den tilladte maximale forureningsgrad
• udvikling af et program til hygiejnekontrol af færdigfortyndede sæddoser.

Afprøvningen blev gennemført med delvis økonomisk støtte fra Dan-Avls KS-stationer.

Undersøgelse af kritiske punkter

Efter udarbejdelse af produktionsdiagram for arbejdet i stalden blev opsamlingen af sæd vurderet til at være det alt overvejende kritiske punkt. I laboratoriet blev følgende hjælpe-midler vurderet at være kritiske punkter;

• opsamlingsbeholder (færdigmonteret og henlagt i skab i syv dage)
• slange til fortynding af sæd til at sætte på tappe/fylde-anlæg (hængt i laboratorium i syvdage)
• tube (opbevaret i syv dage) til påfyldning af færdigfortyndet sæd
• sprøjte, som anvendes til opløsning af Penicillin.

Forbedring af arbejdsprocedurer og fastlæggelse af maximale forureningsgrad

Stald

For at undersøge om den pt. anvendte metode til opsamling af sæd kunne forbedres med hensyn til en reduktion af tilstedeværende mikroorganismer i råsæden, blev følgende sædopsamlingsmetoder afprøvet:

A: Sædopsamling foretaget som beskrevet i ”Regler for drift og smittebeskyttelse på KS-
    stationer (marts 1997)” (4) (pt. anvendte metode). Opsamling i opstaldningsstald med
    strøelse.

B: Sædopsamling foretaget i vasket sti uden strøelse i opstaldningsstalden.

C: Sædopsamling foretaget i vasket og udluftet sti uden strøelse i separat springstald.
    Der blev anvendt vaskede orner (højtryksrenser 35 ºC varmt vand) i opstaldningsstalden
    i stier uden strøelse. Efter afdrypning (5-10 minutter) blev ornerne drevet ind i springstalden

Til hver metode anvendtes et rengjort fantom. Samme fantom blev anvendt til fem opsamlinger pr. metode pr. dag uden rengøring. Samme person forestod samtlige opsamlinger. Der blev skiftet kedeldragt af opsamlingspersonen mellem de to sidstnævnte metoder. Samtidig med opsamlingerne blev ornernes rektaltemperatur målt.

Opsamlingerne blev foretaget således, at fordelingen af orner med hensyn til alder, race m.v. var ens for de tre metoder. Der blev udført ti opsamlinger for hver metode fordelt på to dage. Det vil sige fem opsamlinger pr. dag. Til undersøgelse for mikroorganismer blev der fra hver opsamling udtaget 3 ml råsæd og 3 ml fortyndet sæd. Sæden var fortyndet i forholdet 1 til 40 med EDTA-fortynder uden antibiotika. Sædprøverne blev opbevaret ved 16-18 ºC indtil afsendelse til analyse den efterfølgende dag.

Udover analyse af sædprøver blev den anvendte EDTA-fortynder også undersøgt for mikroorganismer.

Laboratorium

For at undersøge forekomst af mikroorganismer i laboratoriet blev opsamlingsbeholder til råsæd, slange til fortynding af sæd, tube til opbevaring af den færdigfortyndede sæd samt sprøjte, som anvendes til opløsning af Penicillin, sendt til analyse. Der blev udtaget ti enheder af hver hjælpemiddel dog undtaget sprøjte, hvoraf kun én blev udtaget. Samtlige hjælpemidler var inden afsendelse til analyse rengjort og opbevaret i henhold til ”Regler for drift og smittebeskyttelse på KS-stationer (marts 1997)” (4) og afsendt samtidig med sædprøverne.

Bestemmelse af bakterier (kimtalsundersøgelse)

Sædprøver og laboratoriehjælpemidler blev sendt til Miljø- og Levnedsmiddel-centret I/S, Robert Holms Vej 3, 8700 Horsens for kimtalsundersøgelse. Efter flytning, til Fødevaredirektoratet, Fødevareregion Vejle, Dianavej 3, 7100 Vejle.

Sædprøverne blev analyseret efter en metode til analyse for kimtal i drikkevand (5), hvor der efter ti-folds-fortyndning sås ud på agarplader, således at mikroorganismerne kan danne kolonier. Aflæsning af antal kolonier (kolonidannende enheder pr. ml sæd) sker efter 72 timers inkubation ved 21 ºC. Alt efter fortyndingsgrad kan metodens nedre grænse rykkes fra ”mindre end 1” til ”mindre end 1.000” kolonidannende enheder pr. ml.

Hvert hjælpemiddel blev skyllet med 100-150 ml sterilt vand. Skyllevandet blev herefter filtreret gennem et sterilfilter, som fanger de tilstedeværende mikroorganismer (6). Mikroorganismerne på sterilfilteret bliver herefter opslæmmet i sterilt vand og der blev analyseret videre, som beskrevet for sædprøverne.

Alle kimtalsundersøgelser blev påbegyndt samme eller førstkommende dag efter modtagelsen.

For fastlæggelse af den maksimale acceptable forureningsgrad i færdigfortyndet sæd samt på laboratoriehjælpemidler, blev der nedsat en gruppe af personer fra Fødevaredirektoratet, KS-stationerne og Kruuse A/S.

Udvikling af et program til hygiejnekontrol af færdigfortyndede sæddoser

Råsædsprøver og færdigfortyndede sæddoser blev løbende sendt til analyse for indhold af mikroorganismer. De færdigfortyndede sædprøver indeholdt en antibiotikakombination bestående af Penicillin, Streptomycin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen). Samtlige sædprøver blev opbevaret ved 16-18 ºC inden afsendelse. Afsendelse til analyse skete den samme eller efterfølgende dag.

For en del af de færdigfortyndede sæddoser blev sæddoser fra samme ejakulat opbevaret henholdsvis 0, 24 og 72 timer inden analyse, mens den anden del blev analyseret til tiden 0 timer. Opbevaring i op til 72 timer efter opsamling blev udført for at kunne følge udviklingen i kimtal henover tid og vurdere fund af eventuelle resistente mikroorganismer. Det må formodes, at fx tilstedeværende bakterier 24 og/eller 72 timer efter opsamling, er resistente overfor EU-cocktailen. Råsædsprøverne blev alene undersøgt efter 0 timers opbevaring.

Samtlige kimtalsundersøgelser blev udført som beskrevet under afsnittet ”Bestemmelse af bakterier (kimtalsundersøgelser)”. Samtidig blev fundne kim identificeret og klassificeret som henhørende fra stald- eller laboratoriemiljøet, dersom dette var muligt.

Forbedring af arbejdsprocedurer og fastlæggelse af den maximale forureningsgrad
Stald

I tabel 1 er angivet fund af kim i råsæd og fortyndet sæd fordelt på opsamlingsmetode og opsamlingsdag. Der blev anvendt ti opsamlinger pr. metode, da det forventedes, at dette antal ville være repræsentativt for metodens eventuelle indvirkning på antallet af fundne kim.

Overordnet viser tabel 1, at kun i to ud af 30 opsamlinger ligger kimtallet for råsæd lavere end den nedre grænse som analysen opererer med. De resterende 28 opsamlinger ligger med et kimtal fra 2.000-120.000 kolonidannende enheder pr. ml råsæd. Ingen af de fundne kimtal kan begrundes med en eventuel febriltilstand med tilhørende udskillelse af bakterier i sæden hos ornen, da alle temperaturmålinger ligger indenfor eller under normalområdet 38,5 - 39,5 ºC.

De tre anvendte opsamlingsmetoder (A, B og C) var opbygget således, at risikoen for forurening fra omgivelserne var faldende fra metode A til C og tilsvarende forventedes et fald i kimtal henover metode A til C i råsæd. I tabel 1 ses, at dette fald ikke indtraf. Middeltallet, for antal kim i råsæd for metode B, er således lavest.

Da sædplasma fungerer som et opslæmningsmiddel for sædceller og dermed også for tilstedeværende kim, kan det diskuteres om de udtagne prøver til kimtalsundersøgelse, har været repræsentative for det faktiske antal kolonidannende enheder i prøverne. En undersøgelse til afklaring af dette punkt viste, at ved udtagning af 30 prøver råsæd og fortyndede sæddoser, sås en meget lille variation på antallet af kim. Det må derfor konkluderes, at de udtagne mængder af sæd, er repræsentative for det faktiske indhold af kim i sæden.

For de fortyndede sædprøver vist i tabel 1, er antallet af prøver, som ligger lavere end den nedre grænse for analysen, 18 ud af 30 prøver. Dette var også forventet, da der fra råsæd til færdigfortyndet sæd sker en fortyndingseffekt og dermed en reduktion i kimtallet. De resterende prøver ligger i intervallet fra 1.000-190.000 kolonidannende enheder pr. ml færdigfortyndet sæd.

Fortynding af råsæd reducerer kimtallet pr. ml alene under forudsætning af, at fortynderen er steril, at fortyndingen udføres sterilt, og at der ikke sker vækst efter fortyndingen. I tabel 1 ses det, at dette forventede fald ikke indtræffer. Tværtimod ses en stigning i middeltallet for kim for både metode B og C, når man går fra råsæd til færdigfortyndet sæddose. En kontrol af den anvendte EDTA-fortynder viste et kimtal på mindre end 1, svarende til at fortynderen var steril. Da mulig vækst i den fortyndede råsæd samtidig var minimeret, ved hurtig analyse for kimtal efter fortynding, tyder stigningen i kimtal primært på en forurening under selve fortyndingsproceduren.

Tabel 1. Kimtalsbestemmelse*) (kolonidannelse enheder pr. ml) af råsæd og fortyndet sæd. Endvidere er angivet middeltal og spredning (SD)

I tabel 2 er kimtallene opgjort for de tre metoder på de to opsamlingsdage.

Tabel 2. Sammenligning af middeltallet for kim ved anvendelse af de forskellige metoder (A, B og C) fordelt på de to opsamlingsdage. Spredningen er angivet som (SD)

Af tabel 2 ses det, at kimtallene for den fortyndede sæd dag 2 for alle opsamlingsmetoder er signifikant højere end samme tal for dag 1 (p = 0,0018). Den statistiske analyse viser også, at dette alene kan begrundes i en forskel ved fortyndingsproceduren mellem de 2 dage. Samtidig ses det, at dersom kimtal for den fortyndede sæd ”renses” for resultater dag 2, opnås det forventede fald i kimtal ved fortyndingen.

Laboratorium

I tabel 3 er angivet fund af mikroorganismer i de undersøgte laboratoriehjælpemidler.

Tabel 3. Kimtalsbestemmelse*) (kolonidannende enheder) pr. laboratoriehjælpemiddel. Endvidere er angivet middeltal og spredning (SD)

Tabel 3 viser, at samtlige testede hjælpemidler ikke var sterile, ej heller sprøjten som blev anvendt til opløsning af Penicillin. Især slanger til tappe/fylde-anlægget, der anvendes til opsugning af EDTA-fortynder og råsæd, viste kimtal svarende til øverste påvisningsgrænse for analysen (> 1.000 kolonidannende enheder pr. hjælpemiddel).

Rengøring og desinfektion af slanger er beskrevet i ”Regler for drift og smittebeskyttelse på KS-stationer (marts 1997)” (4), hvor slangerne efter gennemskylning med koldt vand skal ligge i en to pct. RBS 35-opløsning (RBS 35 indeholder to pct. natriumhypoklorit - Struers KEBO Lab) i mindst en ½ time. Herefter skylles slanger udvendigt med håndvarmt vand og gennemskylles med mindst 80 ºC varmt vand. Derefter hænges de til tørre på et stativ. Tilstedeværelsen af det høje kimtal i slangerne kan skyldes; at rengørings- og desinfektionsmetoden ikke har virket efter hensigten, at procedurer for rengøring og desinfektion af slangerne ikke er fulgt, at slangerne bliver kontamineret efter rengøring og desinfektion (hænger på et stativ op til en uge inden anvendelse), eller en kombination af de nævnte årsager.

Tabel 4. Kimtalsbestemmelse *) (kolonidannende enheder) pr. slange efter forskellige rengøringsprocedurer. Endvidere er angivet middeltal og spredning (SD)

Yderligere undersøgelser til afklaring af ovennævnte årsagsforhold viste, at den i reglerne beskrevne fremgangsmåde var effektiv og gav sterile slanger som resultat, når metoden blev udført efter forskrifterne. Samtidigt sås, at kogning af slanger i optil ½ time efter iblødsætning med RBS 35 ikke var effektiv, mens tørsterilisation, både ved 100 ºC i 4 timer og ved ºC i 2 timer, efter iblødsætning med RBS 35, som ventet, gav sterile slanger. De enkelte resultater er angivet i tabel 4. Der blev anvendt fem slanger til tappe/fylde-anlæg pr. rengøringsprocedure.

Til fastlæggelse af den maksimale acceptable grænse for kimtal i færdigfortyndet sæd blev det besluttet at anvende grænsen for levnedsmiddelproduktionen ved fremstilling. Denne grænse er et kimtal på mindre end 300 kolonidannende enheder pr. ml. Dette betyder, at ligger kimtallet på over 300 kolonidannende enheder pr. ml færdigfortyndet sæd, kan den hygiejniske standard af den færdigfortyndede sæddosis ikke siges at være i orden.

For laboratoriehjælpemidler må der som udgangspunkt ikke være vækst ved kimtalsundersøgelsen. Dog er grænsen for levnedsmiddelproduktionen på 50 kolonidannende enheder pr. hjælpemiddel acceptabel. Dette betyder, at ligger kimtallet på over 50 kolonidannende enheder pr. laboratoriehjælpemiddel, kan det pågældende hjælpemiddel hygiejniske standard ikke siges at være i orden.

De fastlagte grænser for det maksimalt tilladte antal kim blev anvendt ved den videre udvikling af hygiejneprogrammet, samtidig med at grænserne blev afgørende for, hvornår en identifikation af tilstedeværende mikroorganismer blev udført.

Udvikling af et program til hygiejnekontrol af færdigfortyndede sæddoser

Sideløbende med ovenstående undersøgelser af opsamlingsmetodernes indflydelse på mikroorganismer i råsæd og færdigfortyndet sæd, samt undersøgelse af forurening af laboratoriehjælpemidlerne, blev der løbende indsendt færdigfortyndede sæddoser indeholdende EU-cocktailen til undersøgelse for mikroorganismer.

I afprøvningsperioden blev der i alt undersøgt 1.330 opsamlinger. Disse var fordelt på 444 færdigfortyndede sæddoser, opbevaret 0, 24 og 72 timer efter opsamling (del 1), og 886 færdigfortyndede sæddoser undersøgt umiddelbart efter fortynding (del 2) fra alle Dan-Avls KS-stationer.

Af samtlige sæddoser fandtes 2½ pct. at indeholde over 300 kolonidannende enheder pr. ml sæd. Disse fordelte sig med 5 pct. forurenede prøver i del 1 og 1½ pct. forurenede prøver i del 2. I del 1 sås en stigning i kimtallet henover tid (0 til 72 timer) i 1,1 pct. af prøverne, mens der for de resterende prøver (98,9 pct.) sås et fald.

Stigningen i kimtal henover tid må antages at være begrundet i resistente mikroorganismer. For at imødekomme dette er der samtidigt med denne afprøvning, blevet udviklet en ny kombination af antibiotika som mindsker risikoen for udvikling af antibiotikaresistens hos tilstedeværende mikroorganismer i færdigfortyndede sæddoser. Antibiotikakombinationen består af Amoxicillin og Gentamycin (7).

Udover analyse for kimtal blev prøver med over 300 kolonidannende enheder pr. ml sædprøve også underkastet en identifikation af de fremkomne kolonier. De fundne mikroorganismer var som følger; Pseudomonas spp., Alcaligenes xylosoxidans, Alcaligenes faecalis, Acinetobacter spp., Bordetella spp., samt skimmel- og gærsvampe. Heraf må alene Pseudomonas karakteriseres som en laboratoriemiljøbakterie, mens de resterende mikroorganismer må formodes at stamme fra staldmiljøet. Det skal samtidigt nævnes, at samtlige fundne mikroorganismer ikke udgør nogen risiko, hvad angår fremkaldelse af sygdom.

En statistisk behandling af materialet viser, at der er statistisk sikker effekt af KS-station på forekomsten af forurenede prøver. Denne effekt ses også i rådata, da en enkelt KS-station har leveret lidt over halvdelen af de forurenede prøver.

Samtidigt ses en effekt af, om den foregående prøve fra samme KS-station, har været forurenet. Det vil sige, at er en prøve forurenet, så er risikoen for at de efterfølgende prøver også er forurenet med sikkerhed større, end hvis den første prøve ikke havde været forurenet. Da de udtagne sædprøver er udtaget fra cirka hver 10. opsamling, må det anses for usandsynligt, at der har kunnet finde en forurening sted mellem prøverne. Effekten må derfor tilskrives et generelt højere forureningsniveau i stald og laboratorium på de pågældende dage.

På baggrund af den relativt lave forureningsgrad i samtlige undersøgte sæddoser (2½ pct.) er det pt. ikke økonomisk muligt at udarbejde et stikprøve kontrolprogram, som med statistisk sikkerhed kan afsløre fx en fordobling i forureningsgraden, da dette ville kræve en undersøgelse af et meget højt antal færdigfortyndede sæddoser.

Et lavt antal af mikroorganismer i de færdigfortyndede sæddoser er essentiel for kvaliteten af den udsendte sæd, udtrykt som holdbarhed og befrugtningsevne. En reduktion af tilstedeværende mikroorganismer vil samtidig medvirke til at mindske risikoen for spredning af potentielt sygdomsfremkaldende mikroorganismer, samt resistente mikroorganismer med sæden.

Derfor blev udviklingen af et hygiejnisk kontrolprogram ved hjælp af HACCP-metoden (Hazard Analysis of Critical Control Points s. risikoanalyse af kritiske kontrolpunkter) gennemført på Dan-Avls KS-stationer.

Programmet har omfattet en undersøgelse af forureningsgraden af hjælpemidler i laboratoriet samt af råsæd og færdigfortyndede sæddoser. De kritiske punkter, hvor den største risiko for mulig forurening kunne finde sted, var; under opsamlingen af sæd og i slanger til tappe/fylde- anlæg.

To forskellige metoder til opsamling af sæd er blevet afprøvet og sammenlignet med den pt. anvendte metode. Der sås ingen effekt af de afprøvede opsamlingsmetoder på forurenings-graden af råsæden. Ved undersøgelse af slanger til tappe/fylde-anlæg fandtes en høj forurening. Rengøringsproceduren for slanger til tappe/fylde-anlæg er beskrevet i ”Regler for drift og smittebeskyttelse (marts 1997)”, og ved en rengøring efter disse forskrifter, fandtes slangerne sterile.

I afprøvningsperioden blev i alt undersøgt 1.330 opsamlinger fordelt på 444 færdigfortyndede sæddoser, opbevaret 0, 24 og 72 timer efter opsamling, og 886 færdigfortyndede sæddoser undersøgt umiddelbart efter fortynding.

Af samtlige sæddoser fandtes 2½ pct. at indeholde over 300 kolonidannende enheder pr. ml sæd, hvilket var den fundne maksimale acceptable forureningsgrænse.

Udfra resultaterne af denne afprøvning må det anbefales, at der indføres et hygiejnekontrolprogram til kontrol af tilstedeværende mikroorganismer i slanger til tappe/fylde-anlæg, og i de færdigfortyndede sæddoser. 

Afprøvningen er udført i samarbejde med:
Fagdyrlæge vedrørende svin, Lisbeth Vesterager Borge
Laboratorieleder, dyrlæge Lis Nielsen, Fødevareregion Vejle
Afdelingschef Søren Jørgensen, Hatting-KS, Horsens afdelingen