Koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved flowcytometri

På de danske KS-stationer bestemmes koncentrationen rutinemæssigt i hver sædopsamling ved hjælp af et fotometer, et såkaldt kolorimeter, af typen Corning 254. Princippet i den kolorimetriske koncentrationsbestemmelse er, at en fortyndet sædprøve gennemlyses med en kendt lysmængde af en bestemt bølgelængde. Mængden af lys, som passerer igennem sædprøven måles, og derudfra beregnes den absorberede lysmængde. Absorptionen er proportional med sædcellekoncentrationen i sædprøven.

Koncentrationsbestemmelsen er nødvendig for beregning af fortynding og antal doser pr. ejakulat. Tidligere undersøgelser har vist en spredning på cirka 13 pct.ved gentagne målinger pådet samme ejakulat på koncentrationsbestemmelse af ornesæd med fotometer (1). Opsamlingerne udnyttes derved ikke optimalt, når KS-stationerne i deres beregninger er nødt til at tage hensyn til den relativt dårlige nøjagtighed ved bestemmelse af sædkoncentrationen.

Flowcytometri er en metode til koncentrationsbestemmelse af sæd, der udover koncentrationsbestemmelse også kan bestemme procentdelen af vitale sædceller i et ejakulat. Princippet ved flowcytometri er, at sædceller indfarves med to forskellige farvestoffer med affinitet for DNA. Hvis sædcellerne er vitale, optages kun det ene farvestof, hvorimod døende/døde sædceller optager begge farvestoffer. Farvestofferne i sædcellerne exciteres med laserlys, idet en tynd stråle af sædprøven passerer igennem flowcytometeret og rammes af en laserstråle. To fotoceller registrerer det emitterede lys fra de fluorescerende sædceller, og herved registreres om sædcellen er vital eller non-vital. En intern standard af fluorescerende partikler udsender et signal forskelligt fra de farvede sædceller, og herved muliggøres det samtidig, at bestemme koncentrationen af sædceller. Der tælles cirka 10.000 sædceller pr. prøve. Metoden har været anvendt på tyresæd med god sammenhæng over til tælling af sædceller i tællekammer (2).

Formålet med afprøvningen var, at forbedre koncentrationsbestemmelsen af ornesæd ved hjælp af flowcytometri, for derigennem at forbedre udnyttelsen af de enkelte opsamlinger og dermed KS-stationernes kvalitetsstyring.

Afprøvningen blev gennemført med delvis økonomisk støtte fra Dan-Avl’s KS-stationer og Direktoratet for FødevareErhverv1).

1) Direktoratet for FødevareErhverv, journal nr. 935-2465-Å97-0705

Afprøvningen blev udført på Hatting-KS, Odense afdelingen, i samarbejde med Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole under ”Sædforskningsprojektet” fra november til december 1998.

Prøveudtagning

I forsøgsperioden blev der hver dag over 5 dage udtaget prøver fra 10-15 ejakulater og i alt blev anvendt 58 ejakulater fra 40 orner. Af disse gav 24 orner et ejakulat, 14 gav to ejakulater, mens to orner gav tre ejakulater.

Prøverne bestod af minimum 3 ml råsæd og blev udtaget således, at såvel alle racer, som et bredt udsnit af sædkoncentrationer blev repræsenteret. Prøverne blev mærket med ornenummer og dato. Prøverne blev udtaget og anbragt på et vippebord indtil analyse. De blev maksimalt opbevaret i 5 minutter ved stuetemperatur inden analyse.

Fotometermåling

Der blev udført fotometerbestemmelse på fotometer Corning 254 (C2807) på to uafhængige råsædsprøver pr. ejakulat efter følgende fortyndingsmetode:

Der blev udtaget 0,25 ml råsæd med pipette efter opblanding af råsædsprøven og overført til cüvette. Herefter blev 9,75 ml EDTA-fortynder (ethylen-diamin-tetra-acetat) tilsat med dispenser, hvorefter målingen blev foretaget.

Thomahæmocytometer-tælling

Sædcellekoncentrationen blev bestemt af to personer ved tælling efter følgende metode:

Råsæd (0,50 ml) blev fortyndet med forskellige mængder 5% saltopløsning afhængigt af fotometermålingens værdi.

Formålet med fortyndingsproceduren var, at der for alle sædprøver, uanset koncentration, kun var cirka 20 sædceller pr. felt, det vil sige, at der for hver sædprøve blev talt cirka 200 sædceller pr. tælling. Fortyndingsproceduren er beregnet ud fra en standardkurve udarbejdet i februar 1998 på Hatting-KS, Ringsted afdelingen. Fortyndingsproceduren fremgår af tabel 1.

Tabel 1. Fortyndingsprocedure af råsæd før tælling i thomahæmocytometer

Råsæd og saltopløsning blev grundigt blandet i en sædflaske med låg, idet prøven blev whirlmikset (elektrisk rystet) i 5-10 sekunder og derefter vendt 10 gange på vippeapparat. Tællekammeret blev fyldt ved hjælp af et kapillarrør med sæd-saltopløsningen og eventuel overskydende sæd-saltopløsning blev suget op med filtrerpapir. Tællekammeret blev anbragt på mikroskopet og ladt i ro i ét minut før tællingen. Det samme tællekammer blev anvendt til alle tællinger.

Der blev anvendt et tællekammer af typen thomahæmacytometer. Dette tællekammer består af to kamre, som hver er inddelt i 16 felter. Hvert felt er yderligere inddelt i 16 kvadrater, som er lig med mindste arealenhed.

Tællingerne blev foretaget ved fasekontrastmikroskopi og 200 ganges forstørrelse. I hvert kammer blev der talt fem på forhånd udvalgte felter, jævnfør figur 1. Det var sædcellehovedets placering, som var afgørende for, om sædcellen blev talt med eller ej. Celler i berøring med kanten i højre side og i bunden af tællefeltet blev talt med. Alle sædcellehoveder i dette område blev medregnet. Dette gjaldt også sædcellehoveder uden hale.

Figur 1. Et kammer. Sædceller i de med * markerede felter blev talt og antallet noteret felt for felt

For hvert ejakulat blev der fremstillet to sæd-saltopløsninger, en af hver person. Samme person talte den sæd-saltopløsning, som personen havde lavet. Mellem hver sæd-saltopløsning blev tællekammeret rengjort ved grundig skylning med destilleret vand og efterfølgende grundig tørring med atmosfærisk luft under tryk.

Antal sædceller pr. kubikmillimeter (sædcellekoncentrationen) blev udregnet som:

Celler / kubikmillimeter = summen af talte celler i de 20 felter x omregningsfaktor (beskrevet i tabel 1) x fortyndingsgrad / rumfang af de talte felter.

Rumfang af de talte felter = kvadrat af mindste areal x højden x antal kvadrater pr. felt x antal talte felter.

Da kvadratet af mindste arealenhed er 1/400 kvadratmillimeter, og højden i kammeret er 0,05 mm, kan rumfanget udregnes til 0,04 kubikmillimeter.

Da fortyndingsgraden er 16 x (7,50 + 0,50 / 0,50) vil antal sædceller pr. kubikmillimeter kunne udregnes som:

Antal sædceller pr. kubikmillimeter = summen af talte celler i de 20 felter x omregningsfaktor x 400.

Omregning mellem kubikmillimeter og milliliter foretages som:

Sædceller/kubikmillimeter x 1000 = sædceller/milliliter.

Hvis der opstod større forskel mellem de to tællinger fra samme ejakulat end 10 pct. (forskellen mellem de to fundne sædcellekoncentrationer divideret med et gennemsnit af de to sædcellekoncentrationer, i procent), blev der lavet en ny tælling med en ny sæd-saltopløsning.

Flowcytometermåling

Sperm Count rør blev forberedt ved tilsætning af farvestof til farvning af vitale og non-vitale sædceller. I det ene flowcytometer blev anvendt en 488 nanometer laser (blå), mens der i det andet flowcytometer blev anvendt en 543 nanometer laser (grøn).

Fra råsædsprøven blev der udtaget 20 mikroliter, som blev fortyndet til et totalvolumen på 5 ml i et PBS-medium (fosfat-buffer-opløsning) tilsat 0,1 pct. bovint serum albumin og 0,5 pct. Tetronic 908. Fortyndingen blev foretaget med en Hamilton A503 autodiluter (Struers Kebolab, Albertslund, DK). Fra fortyndingen blev udtaget 60 mikroliter, som overførtes til et Sperm Count rør. Efter tilsætning af fortyndet sæd, placeredes Sperm Count røret på et vippebord af mærket Adams Nutator (N. C. Nielsen laboratorie udstyr), og prøven blev indfarvet i mørke i 4 minutter ved stuetemperatur. Efter indfarvning blev 180 mikroliter overført til et lille glasrør, der blev placeret i flowcytometret og analysen påbegyndtes.

Efter analyse blev data lagret på en diskette i flowcytometret. Analysen blev gentaget på et nyt Sperm Count rør med endnu 180 mikroliter. Således blev fra hvert ejakulat to Sperm Count rør analyseret pr. flowcytometer, det vil sige, at der blev udført fire analyser pr. flowcytometer. Data fra analyserne blev efterfølgende analyseret på et Attractor software (Becton Dickinson, San José, USA), hvorved sædkoncentration og procent vitale sædceller blev beregnet.

Statistisk metode

Følgende variansanalyse blev, for en given metode, anvendt til bestemmelse af apparatpræcisionen:

Fra hvert ejakulat blev der taget otte uafhængige prøver, således at hver af de fire analysemetoder blev undersøgt to gange med sæd fra samme spring. Dog foreligger flowcytometer målingerne (to pr. ejakulat) i sig selv som dobbeltmålinger, altså fire målinger i alt. Ved bestemmelsen af præcisionen nedenfor er dog kun anvendt den første af hver dobbeltmåling for at gøre tallene direkte sammenlignelige med tællekammer og fotometri. Dette gælder også ved undersøgelsen af vitaliteten.

Ved undersøgelse af den systematisk afvigelse fra tællekammeret (nøjagtigheden), er alle fire målinger anvendt. For den manuelle tælling, én tælling pr. person pr. ejakulat, anvendtes et kriterium om, at forskellen på de parvise observationer ikke måtte være større end 10 pct. Herved reduceres metodens varians, mens middelværdien ikke blev påvirket.

Resultaterne af den beskrevne variansanalyse er vist i tabel 2.

Tabel 2. Variansanalyse med systematisk effekt af dag, tilfældig effekt af orne og ejakulat, samt tilfældig variation, knyttet til gentagne målinger

Der er en systematisk effekt af dato, tilnærmelsesvis af samme størrelse for de fire målemetoder. Denne variation er formentlig af biologisk natur, idet der er målt på forskellige ejakulater på forskellige dage.

Variationskoefficienten (CV for gentagne målinger) er et udtryk for præcisionen af de enkelte metoder. Det vil sige jo større CV jo mindre præcision. CV er cirka halvt så stor for de to flowcytometre sammenlignet med måling på fotometer. Samtidig ses ingen forskel i præcisionen af målingerne for de to flowcytometre. CV for de to flowcytometre var 3,4 pct.

Da der er tilfældige fejl på tællingerne, ligesom der er tilfældige fejl på de metoder, der skal vurderes, er det nødvendigt at tage højde for disse fejl ved en undersøgelse af de systematiske afvigelser fra ”guldstandarden”, som her er tællekammeret. Dette gøres ved at antage, at forholdet mellem størrelsen (variansen) af de tilfældige fejl på de to metoder er konstant. Dette forhold kaldes ”delta”. I tabel 3 er anvendt variansen på gentagne målinger fra tabel 2 til udregning af dette forhold, dog er der for flowcytometrene anvendt alle fire målinger i den forstand, at der er taget gennemsnit over de to målinger der udgør én gentagelse. For den blå laser fås således en gentagelsesvarians på 117 i stedet for 145. Det er her rimeligt at anvende alle fire målinger, idet anden måling på hver gentagelse ikke adskilte sig fordelingsmæssigt fra første måling på hver gentagelse.

Tabel 3. Forholdet mellem præcisionen af de enkelte metoder i forhold til manuel tælling

Fra resultaterne i tabel 4 må det antages, at begge flowcytometre har skæring lig nul, mens hældningen er større end én. Efterfølgende forsøg har vist (3), at dette formentlig skyldes en fejl forårsaget af pipettering af stikprøverne fra de anvendte Sperm Count rør og en undervurdering af sædkoncentrationen ved tællekammer undersøgelsen.

Fotometret har en skæring, der er større end nul og en hældning, der er mindre end én. En grafisk fremstilling af resultaterne med indlagt identifikationslinie (fuldt optrukket) er vedlagt i appendiks.

Andelen af normale vitale sædceller målt ved flowcytometri og præcisionen for bestemmelsen er angivet i tabel 5 og 6, henholdsvis.

Tabel 5. Andelen af vitale sædceller

Tabel 6. Variationen på bestemmelsen af vitale sædceller. Der er anvendt den første måling for hver gentagelse

Af tabel 5 ses, at antallet af vitale sædceller i gennemsnit er cirka 86 pct. pr. ejakulat, mens tabel 6 viser en stor apparatpræcision for de to flowcytometre. Målingerne af vitaliteten på samme ejakulat - analyseret på de to flowcytometre - er grafisk fremstillet i appendiks.

Fra i alt 58 ejakulater blev koncentrationen af sædceller bestemt både ved tælling i tællekammer (thomahæmocytometer) og ved måling på to forskellige flowcytometre. Yderligere blev opsamlingerne koncentrationsbestemt på et fotometer af typen Corning 254. Tælling i tællekammer blev fastsat som den sande værdi.

Afprøvningen viser, at målingerne af sædcellekoncentrationen med flowcytometer lå højere end den sande værdi. Efterfølgende forsøg har vist, at dette formentlig skyldes fejl ved pipettering af stikprøver fra de anvendt Sperm Count rør, og at thomahæmacytometeret giver for lave målinger.

Samtidig viser resultaterne en cirka dobbelt så stor præcision af bestemmelsen af koncentrationen af ornesædceller ved flowcytometri, som ved brug af fotometri. Præcisionen for de anvendte flowcytometre er den samme.

Procentdelen af vitale sædceller i de 58 ejakulater var i gennemsnit 86 pct. Ved bestemmelsen på de to flowcytometre blev der også opnået en høj præcision.

Resultaterne af denne afprøvning er således lovende med hensyn til eventuel anvendelse af flowcytometri på KS-stationerne, men årsagen til den observerede overvurdering af sædkoncentrationen ved flowcytometri bør afklares nærmere.