Effekt af human stimulation af søer på oxytocin i blodbanen ved kunstig sædoverføring

Den stigende anvendelse af kunstig sædoverføring (KS) har medført, at soen ikke automatisk modtager de samme stimuli under brunst og inseminering, som ved bedækning. Under bedækning øges oxytocinudskillelsen til blodet hos soen på grund af disse stimuli. Udskillelsen af oxytocin er medvirkende til at forbedre sædtransporten, da oxytocin virker sammentrækkende på muskelcellerne i børen hos soen.

Formålet med denne afprøvning var at undersøge effekten af human stimulation på udskillelsen af oxytocin ved KS og samtidig at afdække, hvornår en eventuel restimulation efter første stimulation, målt i udskillelsen af oxytocin, kunne udføres.

Afprøvningen blev gennemført over to perioder på forsøgsstation Grønhøj, hvor der blev udtaget blodprøver i oktober - december 1999 (del 1) og april - august 2000 (del 2) til brug for oxytocinanalyser.

Afprøvningen blev eksperimentelt opdelt i to dele, således at første del indeholdt indøvelse af kateterisations-, blodprøvestabiliserings- og hormon-analyseteknik, samt en undersøgelse af om der kunne opnås en forskel mellem oxytocinniveau i plasma ved forskellige stimulationsmetoder, mens anden del primært undersøgte oxytocinniveau i plasma ved restimulation 20, 40 og 60 minutter efter første stimulation.

Afprøvningen blev gennemført efter tilladelse fra Forsøgsdyrstilsynet (J.nr. 1999/561-234) til anvendelse af søer og Lægemiddelstyrelsen (J. nr. 2512-8435) til anvendelse af Stresnil®.

Forsøgsstation Grønhøj er en konventionel sobesætning på cirka 600 årssøer. Efter fravænning onsdag indsættes søerne i løbeafdelingen, der er traditionelt indrettet med løbe- og insemineringsbokse fra Maskinfabrikken Jyden Bur A/S. Der findes fire ornestier i løbeafdelingen. Der fravænnes 20-24 søer pr. uge, som løbes med sæd leveret fra DanAvls KS-stationer. Efter løbning forbliver søerne i løbeafdelingen i 3-4 uger indtil erkendt drægtighed. Drægtighedsundersøgelse foregår ved brunstkontrol og drægtighedsskanning, hvorefter drægtige søer overflyttes til drægtighedsafdelingen. Søer, der indgik i afprøvningen, blev udvalgt tilfældigt.

Del 1

Der blev afprøvet tre forskellige stimulationsmetoder: bedækning (A), lav human stimulation (B) og udvidet human stimulation (C). De tre stimulationsmetoder er beskrevet i tabel 1.

Tabel 1. Karakteristik af anvendte stimulationsmetoder

I alt indgik 19 søer, som sammenlagt blev løbet 32 gange. Ved ni løbninger blev der anvendt stimulationsmetode A, ved elleve løbninger blev stimulationsmetode B anvendt og i forbindelse med 12 løbninger blev stimulationsmetode C anvendt. Alle søer blev løbet to gange, såfremt de udviste brunst. Det vil sige, at ud af 19 søer blev seks kun løbet én gang. Ingen søer blev løbet tre gange. Samme so kunne godt modtage forskellige stimulationsmetode ved 1. og 2. løbning. Bedækning med orne (metode A) blev valgt som kontrol.

Der blev brunstkontrolleret to gange dagligt i løbet af weekenden, og søer, der udviste stående brunst søndag, blev løbet mandag morgen og aften (cirka 80 pct.). Søer, som udviste stående brunst mandag morgen, blev løbet mandag og tirsdag (cirka 20 pct.). Ved løbning blev soens alder, udtrykt som lægnummer, registreret. Ved faring blev totalfødte grise pr. kuld registreret.

Der blev udtaget blodprøver to gange dagligt lørdag og søndag. Endvidere blev der udtaget blodprøver før, under og efter bedækning og inseminering med et hyppigere interval (hvert andet til femte minut) op til 50 minutter efter påbegyndt stimulation. Blodprøver blev taget ved hjælp af et centralvenøst kateter (B| Braun, Cavafix® Certo®, kateter: 1,1*1,7 mm/16G, kanyle: 1,8*2,35mm/14G, længde: 45 cm, 36ml/minut) som blev lagt i ørevenen fredag efter fravænning. Ilægning blev foretaget ved anvendelse af sedation ved injektion af Stresnil® i.m. (Azaperone, Bayer, 0,5-1 ml/20kg), og ved anvendelse af trynebremse.

For at undgå tilstopning (clotning) af kateter blev det skyllet og fyldt med saltvand og heparin (1 ml heparin/100ml isotonisk saltvand) efter blodprøveudtagning. Udtagning af blodprøver blev gjort med mindst mulig påvirkning af soen ved hjælp af påsætning af en 30 cm slange på kateteret.

Efter udtagning af 5 ml blod i en engangsplastsprøjte blev blodet overført til en 10 ml vacutainer indeholdende heparin tilsat 0,25 ml Trasylol® (Aprotinin, Bayer). Vacutainere med blod blev vendt seks til ti gange for opblanding. Prøverne blev herefter lagt på isbad i op til 20 minutter før centrifugering ved 1.500g i 20 minutter ved 4 grader celsius. Umiddelbart efter centrifugering blev blodplasma fra hver prøve afpippeteret med en engangsplastpipette og overført til præparatrør af polypropylen, hvorefter de blev opbevaret ved 18 grader celsius. Maksimum 10 dage herefter blev prøverne overført til 80 grader celsius, hvor de blev opbevaret indtil analyse.

Plasma blev analyseret for indholdet af oxytocin ved hjælp af Radio Immuno Assay (RIA) som beskrevet af Hydbring et al. (1999). Før RIA blev tilstedeværende oxytocin i plasma bundet til anti-oxytocinserum (Euro Diagnostica, A19R 772201) og derefter ekstraheret ved anvendelse af acetone (Guarantee Reagent (GR); Merck Darmstadt, Germany), hvorefter blandingen blev centrifugeret ved 1.800g i 15 minutter. Den øverste fase af centrifugatet blev herefter overført til afkølede polypropylen rør, hvor 2 ml petroleum benzen (Guarantee Reagent (GR); Merck Darmstadt, Germany) blev tilsat. Blandingen blev centrifugeret i 10 minutter ved 250g, hvorefter den øverste fase blev fjernet. Den nederste fase blev herefter inddampet i vandbad ved 37 grader celsius. Efter inddampning blev RIA-buffer tilsat i forholdet 0,5 : 0,2, og prøven blev kørt på RIA-apparatet. Genfindelsesprocenten ved den anvendte RIA-metode er opgivet til 92.

Hormonanalyserne for oxytocin blev foretaget på Sveriges Landbruksuniversitet, Afdeling for Dyrefysiologi, Uppsala.

Del 2

Stimulationsmetode C, angivet under del 1, blev anvendt til samtlige løbninger. Restimulation foregik ved at gentage stimulationsmetode C efter enten 20 (stimulationsmetode C1), 40 (stimulationsmetode C2) eller 60 (stimulationsmetode C3) minutter efter løbning. De søer, der udviste stående brunst, blev insemineret ved den første stimulation, men ikke under restimulation.

I alt indgik 26 søer, som sammenlagt blev løbet 46 gange. Ved 16 løbninger blev stimulationsmetode C1 anvendt, mens der ved stimulationsmetode C2 og C3 blev anvendt 15 løbninger til hver metode. Alle søer blev løbet to gange, såfremt de udviste stående brunst. Det vil sige, at ud af 26 søer blev seks kun løbet én gang. Ingen søer blev løbet tre gange. Samme so kunne godt modtage forskellig restimulationsmetode ved 1. og 2. løbning.

Kateterisation, blodprøveudtagning og analyse blev fortaget som angivet i del 1. Der blev dog kun udtaget blodprøver mandag og tirsdag før, under og efter stimulation og restimulation. Ved løbning blev soens alder, udtrykt som lægnummer, registreret. Ved faring blev totalfødte grise pr. kuld registreret.

Til statistisk behandling af oxytocinindholdet i blodplasma blev SAS proceduren Proc GLM anvendt i både del 1 og 2. Herudover blev der anvendt beskrivende statistik, hvor dette blev anset for nødvendigt.

Oxytocinniveauet i plasma før stimulation (basalniveau) og stigningen i oxytocinniveau henover tid fremgår af tabel 2.

Basalniveauet indenfor hver stimulationsmetode er bestemt som gennemsnittet af alle målinger af oxytocin foretaget før stimulationens start. Oxytocinniveauet i de angivne tidsintervaller efter stimulationsstart er bestemt som gennemsnittet af alle oxytocinmålinger foretaget i de respektive tidsperioder.

Som det ses af tabel 2, var der ingen forskel i basalniveauerne af oxytocin, inden påbegyndelse af stimulation mellem de enkelte stimulationsmetoder, sammenlignet med kontrolgruppen. Det gennemsnitlige basalniveau af oxytocin, for de 19 søer som indgik, var 12,1 pmol/l.

For oxytocinniveau 0-10 minutter efter påbegyndt stimulation sås ingen forskel mellem stimulationsmetode C og kontrolgruppen, mens stimulationsmetode B gav værdier af oxytocin, som var statistisk sikkert lavere end kontrolgruppen. Oxytocinniveauet 10-20 minutter efter påbegyndt stimulation var statistisk sikkert større i kontrolgruppen end for de to andre metoder, som ikke gav forskelligt resultat fra hinanden. Oxytocinniveauet 20-30 minutter efter påbegyndt stimulation gav en tendens (p=0,06) til højere oxytocinniveau hos kontrolgruppen end for stimulationsmetode B. Her var metode C ikke forskellig fra kontrolgruppen. Dette forhold udlignede sig henover tid, således at basalniveauet for oxytocin i plasma for alle tre metoder blev nået 30-40 minutter efter påbegyndt stimulation. I figur 1 er resultaterne fremstillet grafisk.

Tabel 2. Oxytocinniveau i plasma hos søer før, under og efter stimulation til stående brunst og inseminering. I alt var 19 søer inkluderet

*      1*10-¹² mol pr. liter plasma
**    Standardafvigelse
***  Kontrolgruppen havde en tendens til at være større end metode B (p=0,06). 
       Kontrolgruppen var ikke forskellig fra metode C.
       Forskelligt bogstav indenfor række angiver statistisk sikker forskel mellem tallene (p<0,05)

Den gennemsnitlige alder, udtrykt som lægnummer, indenfor hver stimulationsmetode var; metode A = 6,3, metode B = 5,5 og metode C = 4,7. Der var ingen effekt af alder på de opnåede resultater for oxytocin.

Der kunne ikke findes en sammenhæng mellem oxytocinniveau og totalfødte grise pr. kuld ved de forskellige stimulationsmetoder, da antallet af søer, som indgik, var for lille. Dette skyldes, at alene søer, der havde modtaget samme stimulationsmetode ved 1. og 2. løbning kunne anvendes. Gennemsnit og standardafvigelse for antal totalfødte grise pr. kuld for de forskellige stimulationsmetoder var; metode A = 12,3 (3,8) (n = 3), metode B = 14,3 (5,5) (n = 3) og metode C = 13,8 (2,5) (n = 4). I alt indgik således kun ti søer i opgørelsen.

Del 2

Oxytocinniveau i plasma før stimulation (basalniveau) og stigningen i oxytocinniveau henover tid fremgår af tabel 3.

Tabel 3. Oxytocinniveau i plasma hos søer før, under og efter stimulation til stående brunst og inseminering, samt efter restimulation 20, 40 og 60 minutter efter første stimulation. Der var i alt inkluderet 26 søer.

Tallene i tabel 3 er beregnet som i tabel 2. Som det ses af tabel 3, var der ingen forskel i basalniveauerne af oxytocin, inden påbegyndelse af stimulation, mellem de enkelte restimulationsmetoder. Det gennemsnitlige basalniveau af oxytocin for de 26 søer, som indgik, var 11,5 pmol/l.

Sammenlignes det basale oxytocinniveau for alle restimulationsmetoder med det opnåede oxytocinniveau 0-10 minutter efter stimulation ses en signifikant stigning i oxytocinniveau. Dette bekræfter resultaterne fra del 1. I tabel 3 er de tidsintervaller, som relaterer sig til restimulation fremhævet med ”fede tal”. Disse adskiller sig ikke, som forventet, fra basalniveauet. Her skal det nævnes, at søerne blev insemineret ved første stimulation, mens dette ikke blev gjort ved restimulation. Dette kunne være en forklaring på de lavere oxytocinniveauer opnået ved restimulation, da det fra litteraturen vides, at selve insemineringen via påvirkning med kateter af børhals, sædens volumen og indholdsstoffer i sæden, vil virke som stimulation af soen, og dermed være medvirkende til en øgning i udskillelsen af oxytocin.

Resultatet i del 2 dækker over store variationer i oxytocinniveau mellem de søer, der leverer resultater til de relevante tidsintervaller. Således viser det sig, at ca. 1/3 af søerne giver en stigning i oxytocinniveau ved restimulation, som er sammenligneligt med eller højere end niveauet, der blev opnået ved første stimulation. De resterende 2/3 søer fordeler sig ligeligt mellem en gruppe, hvor der ikke ses en stigning, og en gruppe hvor stigningen er tvivlsom.

Som eksempel er der i figur 2 vist oxytocinniveau fra to forskellige søer ved første stimulation og restimulation 40 minutter efter.

I figur 2 ses, at den ene so viser en reaktion på stimulation til tiden 0 og restimulation til tiden 40 minutter efter (kurven med høje toppunkter), mens den anden so hverken under stimulation eller restimulation fraviger basalniveauet.

Den gennemsnitlige alder, udtrykt som lægnummer, indenfor hver restimulationsmetode var; metode C1 = 3,5, metode C2 = 3,8 og metode C3 = 3,3. Der var ingen effekt af alder på de opnåede resultater for oxytocin.

Der kunne ikke findes en sammenhæng mellem oxytocinniveau og totalfødte grise pr. kuld ved forskellige restimulationsmetoder, da antallet af søer, som indgik, var for lille. Dette skyldes, at alene søer, der havde modtaget samme restimulationsmetode ved 1. og 2. løbning kunne anvendes. Gennemsnit og standardafvigelse for antal totalfødte grise pr. kuld for de forskellige restimulationsmetoder var; metode C1 = 13,7 (4,6) (n = 3), metode C2 = 15,7 (2,5) (n = 3) og metode C3 = 11,3 (2,3) (n = 3).

Sammenlignes resultaterne i del 1 og 2 ses, at basalniveauerne er sammenlignelige, hvilket indikerer, at søerne i begge forsøg har været udsat for samme mængde af stimulation og stress inden stimulationen påbegyndtes. Et gennemsnit for basalniveauet af oxytocin for alle søer er 11,8 pmol/l. Basalniveauet ligger således i denne afprøvning højere end i lignende forsøg af Claus og Schams (1990).De fandt et basalniveau omkring 1 pmol/l, men i dette forsøg var der ikke konstant ornekontakt, som det var tilfældet i denne afprøvning, hvilket kunne forklare en del af forskellen. Samtidig kan det ikke udelukkes, at en tidsmæssig forskel i blodprøvetagning i relation til fravænningstidspunkt kan have haft en indflydelse. I forsøget af Claus & Schams gik søerne først i forsøg i anden brunstcyklus efter fravænning, mens blodprøvetagning i hosliggende afprøvning blev udført allerede ved første observation af brunst efter fravænning.

På baggrund af de opnåede niveauer af oxytocin i del 1, må det anbefales, at anvende en udvidet human stimulation af søerne ved brunstkontrol og inseminering, da dette medfører et niveau af oxytocin i blodbanen, som ikke er forskelligt fra det niveau, som kan opnås ved bedækning med orne. Samtidigt må det anbefales, at søerne bliver insemineret indenfor en periode på 20 minutter efter stimulation, da niveauet af oxytocin i dette tidsrum er højest.

Udfra resultaterne i del 2 alene kan det ikke afgøres, hvornår en eventuel restimulation udtrykt i tid efter første stimulation kan anbefales. Dette skyldes for stor variation mellem søerne. Ses der derimod samtidigt på resultaterne i del 1, vist i tabel 2 og figur 1, er det i tidsintervallet 0-20 minutter efter stimulation, at oxytocinniveauet er højere end basalniveauet, mens der for tidsintervallet 20-30 minutter stadig er en tendens til et højt niveau. Det må derfor anbefales at vente minimum 30 minutter efter første stimulation, før restimulation eventuelt udføres.

Hypofysehormonet oxytocin er kendt for dets sammentrækkende virkning på de glatte muskelceller i børen på soen og dermed medvirkende til transporten af sæd fra børhalsen til stedet for befrugtning i æggelederen. Udskillelsen af oxytocin i blodbanen menes at være forårsaget af den seksuelle stimulation, som soen modtager.

For at undersøge effekten af human stimulation på niveauet af oxytocin i blodbanen hos søer, blev der udført en afprøvning, hvor søerne ved brunstkontrol og inseminering blev stimuleret meget (udvidet) eller lidt (lavt). Som kontrolgruppe anvendtes bedækning med orne.

Resultaterne viste, at der ved udvidet human stimulation kunne opnås oxytocinniveauer, som ikke var forskellig fra de niveauer, som blev opnået ved bedækning med orne. Derimod gav gruppen af søer, som modtog lav stimulation ved brunstkontrol og inseminering, ikke niveauer af oxytocin, som var forskellig fra basalniveauet. Det må derfor anbefales, at anvende en udvidet human stimulation af søer ved brunstkontrol og inseminering. Endvidere fandtes det højeste oxytocinniveau i blodbanen i op til 20 minutter efter den udvidede humane stimulation, hvorfor det anbefales, at søer, som er stimuleret op, insemineres indenfor dette tidsrum.

Herudover blev det undersøgt, hvornår et højt niveau af oxytocin i blodbanen atter kunne opnås ved restimulation, dvs. en ny human stimulation efter den første stimulation. Søerne blev restimuleret henholdsvis 20, 40 og 60 minutter efter den første stimulation. I alle tilfælde blev der anvendt udvidet human stimulation, og søerne blev alene insemineret ved første stimulation.

Resultatet viste, at kun godt 1/3 af søerne gav en stigning i oxytocinniveau ved restimulation, som var sammenligneligt med eller højere end niveauet opnået ved første stimulation. De resterende 2/3 søer fordelte sig ligeligt mellem en gruppe, hvor der ikke sås en stigning og en gruppe, hvor stigningen var tvivlsom. Denne fordeling gjaldt for samtlige søer uanset restimulationstidspunkt efter første stimulation. Den store variation mellem søerne ved restimulation kan have været forårsaget af, at der ikke blev insemineret ved selve restimulationen, da det fra litteraturen vides, at selve inseminering via påvirkning med kateter af børhals, sædens volumen og indholdsstoffer i sæden, virker stimulerende på soen, og er dermed medvirkende til en øgning i udskillelsen af oxytocin.

Udfra disse resultater kan det derfor ikke afgøres, hvornår en eventuel restimulation udtrykt i tid efter første stimulation, kan anbefales. Ses derimod på resultaterne af første forsøg, er det i tidsintervallet 0-20 minutter efter stimulation, at oxytocinniveauet er højere end basalniveauet, mens der for tidsintervallet 20-30 minutter stadig er en tendens til et højt niveau. Det må derfor anbefales, udfra denne afprøvning, at vente 30-40 minutter efter stimulation, før eventuel restimulation udføres.