Ergosterol - et nyttigt værktøj ved vurdering af svampebelastning

Ergosterol er en analyseparameter, der er specifik og sensitiv som mål for svampevækst. Der er fundet følgende normalniveauer (x ± s) af ergosterol i danske afgrøder (μg/g):

byg: 7,6 ± 2,8, brødhvede: 5,0 ± 1,5, brødrug: 6,8 +2,2, ærter: 2,2 + 2,7, raps: 2,4 ± 1,3.

Der er en forskel mellem vækstår, som kan forklares ved de vejrmæssige forhold.

Svampetoksinholdige prøver er fundet at indeholde væsentligt mere ergosterol end normalprøver: byg 24,4 + 12,1, hvede: 13,3 + 4,0. For ochratoksin i byg er fundet en god sammenhæng mellem toksinog ergosterolindhold, således at grænsen for indhold af ochratoksin ligger på 25 μg/g ergosterol. For fusarietoksiner findes ikke en tilsvarende sammenhæng.

For bomuldsfrøskrå og -kager ses en sammenhæng mellem indhold af aflatoksin B og ergosterol, således at grænsen ligger ved 4 μg/g ergosterol.

Ved sammenligning med kvalitetsparameteren "brændte kerner" i rapsfrø ses, at alle prøver med 1,4 μg/g ergosterol har forhøjet indhold af brændte kerner.

Ved varmebehandling af produkter (pelletering, tromlebehandling) ses en reduktion på maksimalt 25 pct. (ved 130 °C i produkttemperatur). Ergosterol er således også anvendelig til vurdering af varmebehandlede produkter.

Ved affedtning overgår hovedparten af ergosterol i fedtfasen, og indholdet i kage-/skråvaren bliver lavt. I en vurdering skal produktets fedtindhold sandsynligvis indgå.

Den anvendte HPLC-metode er reproducerbar og relativt simpel. Den kan dog ikke anvendes til modtagekontrol, da analysen tager nogle timer.

Scannende NIR (Nær Infrarød Refleksion) er undersøgt som hurtigmetode. Standard Error of Prediction (SEP) er ca. 3,0, hvilket ikke vil give en tilstrækkelig god analysenøjagtighed. Det vil derfor være relevant at arbejde videre med andre hurtigmetoder.

Til vurdering af blandede materialer er ergosterolanalysen kun egnet med forbehold.

Ergosterolanalyse er p.t. egnet til følgende formål:

vurdering af forløb med hensyn til svampebelastning,
vurdering af enkeltprøver af ublandede produkter, også når de er varmebehandlet,
som led i et kvalitetsstyringssystem,
som handelsanalyse, hvor ergosterols stabilitet og analysens reproducerbarhed gør den specielt egnet.

Baggrund

Lige siden mennesket begyndte at dyrke og opbevare afgrøder, er der foregået en uendelig kamp for at forhindre skadegørere i at fortære eller ødelægge høsten.

Vore kultiverings- og lagringssystemer er i en fundamental konflikt med naturens trang til variation og recirkulering ved nedbrydningsprocesserne.

Svampe er den vigtigste faktor for begrænsning af lagertiden for produkter med lavt vandindhold (vandaktivitet 0,6-0,9), med lavt pH og/eller med tilsatte konserveringsmidler. Ligeledes har svampeangreb på marken stor betydning for plantens og det høstede produkts sundhed.

Svampeangreb kan bevirke dannelse af svampetoksiner, reduktion af næringsværdi, smagelighed eller spireevne. Skadevirkningen hos konsumenten omfatter kræft, reproduktionsproblemer, nyreskader, indre blødninger, allergier og immundefekter m.fl.

Traditionel svampebestemmelse

Kvantificering af svampevækst i foder og levnedsmidler har længe været en fagdisciplin, og der findes et stort antal metoder. Da disse i det følgende vil blive anvendt til sammenligning med måling af ergosterolindhold, skal der kort gives en oversigt over principperne. De fleste metoder baseres på fremvækst af kolonier, det vil sige, at der kun detekteres levende svampe, som er i stand til at vokse under de givne omstændigheder.

Tælling af kolonidannende enheder (cfu) eller pladespredningsteknik er en metode, der er overtaget fra bakteriologien. Prøven opslæmmes og homogeniseres i sterilt vand, fortyndes eventuelt og udsås med et næringssubstrat i petriskåle. En lang række forskellige substrater er anvendt. Det selektive princip kan være reduceret vandaktivitet, lavt "pH", antibiotika eller fungicider. Antibiotika er nu det foretrukne princip, evt. i kombination med fungicider, der hæmmer hurtigtvoksende svampe, saledes at overvoksning undgås.

Skimmelsvampe er differentierede organismer i modsætning til gærsvampe og bakterier. De kan bestå af vegetativt mycelium og forskellige former for sporebærende legemer. Antallet af kolonidannende enheder vil normalt være et udtryk for antallet af sporer og er derfor ikke et entydigt billede af den totale mængde af væv. Svampenes sporulering - sporedannelse - vil være stærkt afhængig af svampeart, substrat og ydre forhold som temperatur og ilt-tilgang.

Alternativt anvendes bestemmelse af kontaminationsgrad for prøver i partikelform, f.eks. korn. Man bestemmer kernernes indre kontamination, idet disse først overfladesteriliseres. Derefter udlægges de på et næringssubstrat, og man registrerer antallet af kerner, hvorfra der vokser svampe.

Denne metode er som den foregående afhængig af, at svampene er i live. Detektionsområdet er ret snævert, idet metoden ikke kan registrere yderligere svampevækst, når 100 pct. kontaminerede kerner er nået. Dette ses ofte ved kraftige lagerskader (Müller og Thaler, 1979).

Herudover anvendes vurdering ved syn og lugt og direkte mikroskopi, eventuelt efter farvning af svampemycelium. Disse metoder er dog også yderst vanskelige at kvantificere.

En væsentlig faktor i svampenes produktødelæggelse er produktionen af toksiner. Disse er generelt varmestabile, mens svampene selv let dræbes ved varme eller andre dårlige betingelser.

Svampetoksinanalyser er forholdsvis langsomme og komplicerede, og der gives normalt kun tilfredsstillende svar for et enkelt toksin eller en snæver gruppe af toksiner. Dette skal ses i relation til, at skimmelsvampe isoleret fra foder og fødevarer er i stand til at producere et meget stort antal toksiner (ca. 200), hvoraf mange endnu ikke er undersøgt toksikologisk.

Formål

Formålet med dette arbejde er at undersøge muligheden for at anvende en kemisk parameter til vurdering af svampebelastning og dermed risiko for indhold af toksiner. Metoden skal være objektiv, således at dens resultater kan anvendes i normfastsættelse, handelsbetingelser m.v. Ud fra de indledende overvejelser er stoffet ergosterol valgt, begrundelsen herfor fremgår af de følgende kapitler.

Konklusion

De potentielle anvendelser for ergosterolanalyser kan ridses op som følger:

Vurdering af forløb, f.eks. ved forskellige behandlinger af afgrøden på marken, eller ved forskellige lagringsprocedurer.
Vurdering af enkeltstående prøver med hensyn til generel kvalitet eller risiko for sundhedsmæssige problemer.
Som led i et kvalitetsstyringssystem i den industrielle produktion.
Som handelsanalyse.

Analysens hurtighed, sikkerhed og omkostning har betydning for alle anvendelser. Ud fra litteraturen og fra egne undersøgelser kan konkluderes:

Ergosterolmålinger er velegnede til at udtrykke udviklingen i svampefloraen igennem et forløb og er derved en god parameter til at vurdere forskellige behandlingers betydning for svampevækst. Til dette formål er også traditionelle mikrobiologiske analyser anvendelige, men ergosterolmålingen har den fordel, at den udtrykker massen af svampevækst og ikke f.eks. sporulering.

Til vurdering af enkeltstående prøvers mikrobiologiske status har der indtil nu kun været indirekte og mangelfulde metoder til rådighed. Ergosterolanalysen er egnet til bedømmelse af ublandede produkter, for hvilke der eksisterer et relevant erfaringsgrundlag. Specielt for produkter, hvor en bestemt mikrobiologisk omsætning er dominerende, ses en god sammenhæng mellem toksinbelastning og ergosterol (f.eks. ochratoksinindhold i lagret korn). I varer, hvor en række forskellige mikrobiologiske problemer er mulige, ses en mindre tydelig sammenhæng. For forekomst af fusarietoksiner (zearalenon og trichothecener) synes det vanskeligt at sætte en entydig nedre grænse for ergosterolindholdet. Generelt kan det dog siges, at toksinholdige prøver har høje ergosterolindhold, og at højt ergosterolindhold dermed indikerer risiko for toksiner.

Svampevækst i produkter giver anledning til en række mere eller mindre kendte produktionsmæssige problemer. Det er derfor relevant at anvende et mål for svampevækst som generel kvalitetsparameter - uanset om der kan etableres en sammenhæng til indhold af kendte toksiner eller ej

Grænseværdierne vil til denne anvendelse primært være bestemt af "det muliges kunst", idet grænseværdier sættes efter det indhold, der findes i produkter på markedet. Her kan f.eks. anvendes en 90 pct. fraktil.

Grænseværdierne skal sættes ud fra relevante varer, hvilket betyder, at der skal tages hensyn til variation imellem høstår og dyrkningssted.

Forskellige råvarer indeholder væsentligt forskellige niveauer af ergosterol. Derfor er en vurdering af blandinger meget vanskelig. Kun for råvarer, som indgår i betydelige mængder, og som har et højt normalniveau, vil et forøget ergosterolindhold kunne detekteres i blandingen. For eksempel kan det i en foderblanding detekteres, hvis der er anvendt et svampebelastet kornparti, mens muggen sojaskrå ikke kan måles. Til blandinger kan et lavt ergosterolindhold derfor ikke tolkes som garanteret svampefrit produkt.

Den store variation i ergosterolindholdet mellem forskellige produkter skyldes bl.a., at nogle produkter er mere udsat for svampevækst end andre. En opkoncentrering af svampemateriale under teknisk fraktionering kan også være en forklaring. Såfremt svampevækster skyldes en kendt, kontrolleret omsætning i produktet, kan høje ergosterolniveauer ikke tages som udtryk for dårlig kvalitet. Men i alle andre tilfælde vil varer med høje ergosteroltal også være stærkere belastede med uønskede svampemetabolitter.

Varmebehandling påvirker ergosterolindhold, men de processer, der anvendes i praksis vil kun give en mindre reduktion (10-25 pct.), hvorfor ergosterolindholdet også i varmebehandlede produkter kan anvendes som indikator - i modsætning til mikrobiologiske svampebestemmelser.

Ergosterol følger fedtfasen, hvorfor affedtede produkter har et lavt indhold. Mange svampetoksiner vil forblive i skrå- eller kageproduktet, således at "risikoniveauet" for ergosterol for denne type produkter ligger forholdsvis lavt.

Der ses en tydelig sammenhæng mellem ergosterol og aflatoksin i kage- og skråprodukter, men betydningen af produktets fedtindhold er ikke belyst tilstrækkeligt til at angive grænseværdier. Det kan konkluderes, at ergosterolanalysen er egnet til at vurdere svampebelastning af ublandede produkter, for hvilke der eksisterer et erfaringsmateriale. Vurderingen er i forhold til andre metoder mindre afhængig af kendskab til produktets forhistorie.

Ergosterolanalysen er meget egnet som led i kvalitetsstyringssystemer i industrien. En rutinemæssig analyse vil hurtigt etablere videngrundlaget for vurderingen. Analysen kan bekræfte, at råvarekvaliteten er normal, og såfremt indholdet er forhøjet, er der bevis for en svampebelastet vare. I kvalitetsstyringssystemet kan fastsættes normer for, hvor højt ergosterolindholdet må være, og den aktion, der skal tages ved konstaterede overskridelser. Målingerne kan både bruges i råvare- og lagerkontrol. Til beskrivelse af kvaliteten i handelspartier er ergosterolanalysen meget velegnet. Ud fra normalniveau kan fastsættes absolutte grænser, der kan kontrolleres ved autoriserede analyser.

Kvalitet af ergosterolanalysen med hensyn til præcision og sikkerhed gør den særdeles velegnet til at indgå i handeskontrakter. Forslag til ergosterolnormer er angivet i tabel 20. Den nuværende HPLC-metode er god og sikker, men ikke særlig hurtig og billig. Under projektet er undersøgt muligheden for at anvende NIR (Nær Infrared Refleksion) som hurtigmetode. Resultaterne herfra er dog ikke tilfredsstillende, så det må konkluderes, at dette princip ikke er specielt egnet. For en øget udbredelse, specielt til modtagekontrol, vil en pålidelig hurtigmetode være nødvendig. Vi har i projektet overvejet følgende, lovende metoder:

Immunologiske kit til ergosterol eller generelt svampe
HEAD-SPACE ved hjælp af gaskromatografi

Ergosterolmetoden er klar til anvendelse. Industri, som modtager mange partier af samme vare, kan gå i gang. Ligeledes de, som har ansvaret for lagring af produkter. Til vurdering af enkeltprøver vil det foreliggende datamateriale kunne anvendes, men det bør stadigt udbygges med flere varer og data fra flere høstår. Dette vil være en typisk opgave for landbrugets organisation og/ eller foderstofindustrien.

Udvikling af den nødvendige hurtigmetode vil typisk være en opgave for Bioteknologisk Institut. Vi håber på muligheder for at fortsætte dette arbejde.

Reference
-	-, 1983: Calciferole. Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie. Band 23: 639-643. Verlag Chemie.
-	-, 1985: Biotic stresses. Disease-. Grain molds. p 21-22 i ICRISAT, Annual Report 1985.
-	Barton, D. H. R., Corrie, J.E.T., Marshall, P.J. og Widdowson, D.A., 1973: Biosynthesis of terpenes and steroids. VII. Unified Scheme for the biosynthesis of ergosterol in Saccaromyces cerevisfae. Bioorganic chem. 2: 363-373.
-	Bechtel, D.B., Kaleikau, K.A., Gaines, R.L. og Seitz, L.M., 1985: The effects of Fusarfum graminearum infection on wheat kernels. Cereal Chem. 62(3): 191-197.
-	Breivik, O.N. og Owades, J.L., 1957: Spectrophotometric semimicrodetermination of ergosterol in yeast. Agric. Food Chem. 5(5): 360-363.
-	Brubacher, W., Hausheer, O. Wiss og Huschke, G., 1965: XI Die Vitamin D-gruppe. Handbuch der Lebensmittelchemie, bd. I: 10251030 i J. Schormüller (ed.), Springer Verlag.
-	Buchholz-Kühn, K., 1989: Produktion von Ergosterin und Toxinen durch Fusarien in Getreide. Diss. Fak. I. Allgemeine und Angewandte Naturwissenschaften der Universität Hohenheim, Stuttgart, Tyskland.
-	Cahagnier, B., Richard-Molard, D., Polsson, J. og Desserme, C., 1983: Evolution de la teneur en ergosterol des grains au cours de la conservation. Sciences des alimente 3: 219-244.
-	Dart, R.K., IyayI, C. B . , og Offem, J.O., 1985: Rapid detection and counting of spollage fungi. Rev. Env. Health V(3): 255-270.
-	Donald, W.W. og Mirocha, C.J., 1977: Chitin as a measure of fungal growth in stored corn and soybean seed. Cereal Chem. 54(3): 466-474.
-	Dulaney, E.L., Stapley, E.O. og Simpf, R., 1954: Studies on ergosterol production by yeasts. Appl. Microbiol. 2: 371-379.
-	Fryberg, M., Oehlschlager, A.C. og Unrau, A.M., 1973: Biosynthesis of ergosterol in yeast. Evidence for multiple pathways. J. Amer. Chem. Soc. 95(17): 5747-5757.
-	Fryberg, M. , Oehlschlager, A . C . og Unrau, A. M. , 1975: Sterol biosynthesis in antibiotic sensitive and resistant Candida. Arch, Biochem. Biophys. 173: 171-177.
-	Gordon, T.R. og Webster, R.X., 1984: Evaluation of ergosterol as an indicator of infestation of barley seed by Drechelera graminea. Phytopathology 74(9): 1125-1127.
-	Goulston, G., Mercer, E.I. og Goad, L.J., 1975: The identification of 24-methylene-24,25-dihydrolanosterol and other possible ergosterol precursors in Phycomyces blakesleeanus and Agaricus campestris. Phytochem. 14: 457-462.
-	Green, J., 1951: Studies on the analysis of vitamin D. 1. The reaction of vitamins D and related substances with iodine trichloride. Biochem. J. 49: 36-45.
-	Gruda, I., Nadeau, P., Brajtburg, J. og Medoff, G., 1980: Application of differential spectra in the ultraviolet-visible region to study the formation of amphotericin B-sterol complexes. Biochim. Biophys. Acta 602: 260-268.
-	Horst, R.L., 1984: Recent advances in the quantitation of vitamin D and vitamin D metabolites. I:Kumar R. (ed.). Vitamin D. Martinus Nijhoff. Publ. Boston: 423-478.
-	Hubbard, J.D., Seltz, L.M. og Mohr, H.E., 1979: Determination of hexosamines in chitin by ion-exchange chromatography. J. Food Sci. 44(5): 1552-1553.
-	Kaminski, E., Wasowicz, E. og Gruchata, L., 1983: Determination of ergosterol by GLC in fat containing raw material as a criterion of mould invasion. Fat Sci. Proc. 16th ISF Congress, Budapest, 1983.
-	Kaminski, E., Wasowicz, E., Przybylski, R. og Stswickl, S., 1985: Schnellmetoden zur Feststellung von Qualitätsveränderungen bei der Lagerung von Weisen. Getreide, Mehl und Brot 39(6): 170-174.
-	Rasparsson, A., 1986a: The role of fungi in deterioration of stored feeds. Dissertation. Inst. Mikrobiologi, Lantbruksuniversitetet, Uppsala. Report nr. 31.
-	Rasparsson, A., 1986b: Grown and activity of Asp. amstelodami and Pen. verrucosum var. cyclopium in colonization of barley grain. In manuscript ref. in Kasparsson, A., 1986a.
-	Kato, T., 1986: Sterol blosynthesis in fungi, a target for broad spectrum fungicides. I: Hang, G. og Hoffmann, H. (ed.): Sterol biosynthesis inhibitors and anti-feeding compounds: 1-25. Springer Verlag.
-	Lew, H., 1981: Chemische Indikatoren für den Verpilzungsgrad eines Futtermittels. Wien tierärztl. Mschr 68: 305-308.
-	Martens, H. og Næs, T., 1989: Multivariate Calibration. ISBN O 471 90979 3.
-	Mermet-Bourier, R., 1971: The separation of the photochemical isomers of ergosterol by thin-layer chromatography. J. Chromatogr. 59: 226-230.
-	Miller, J.D. og Young, J.C., 1983: Fusarium toxins in field corn I. Time course of fungal growth and production of deoxynivalenol and other mycotoxins. Can. J. Bot. 61: 3080-3087.
-	Miller, J.D. og Young, J.C., 1985: Deoxynivalenol in an experimental Fusarium graminearum infection of wheat. Can. J. Plant Pathol. 7: 132-134.
-	Miller, J.D., Young, J.C. og Sampson, D.R., 1985: Deoxynivalenol and Fusarium head blight resistance in spring cereals. Phytopath. Z. 113: 359-367.
-	Miller, J.D., LaFlamme, A.M., Sobol, Y., Lafontaine, P. og Greenhalgh, R., 1988: Fungi and fungal products in some Canadian houses. Int. Biodeterioration 24: 103-120.
-	Müller, H. og Voigt, B., 1984: Bestimmung von freiem und gebundenem Ergosterol in Mikroorganismen. Ztschr. allgem. Microb. 24(1): 61-64.
-	Müller, N.-M. og Thaler, H., 1979: Mikrobiologische Probleme der Futtermitteluntersuchung. Ubers. Tierernährg. 7: 149-157.
-	Müller, H.-M. og Thaler, M., 1980a: Mikroflora und Mykotoxine bei der Beluftnungstrocknung von Körnermais. Landwirtsch. Forsch. SH 37: 403-415.
-	Müller, H.-M. og Thaler, M., 1980b: Konservierung von Körnermais mit Methylpropionsäure und Propionsäure. Landwirtsch. Forsch. SH 37: 439-448.
-	Müller, H. -M. og Hdrber, 1981: Abbau der Propionsäure durch Schimmelpilze. Landwirtsch. Forsch. SH 38: 638-646.
-	Müller, H.-M., Pfizenmaier, P. og Kändler, U., 1984: Zur quantitativen Bestimmung des Pilzwachstums in Futtermitteln. Landwirtsch. Forsch. 37(2): 166-174.
-	Müller, H.-M., Pfizenmaier, P. og Burgert, P., 1985: Einfluss der Propionsäuredosierung auf die Entwicklung von Pil zen und den Propionsäure-abbau in einem Mischfutter. Z. Tierphysiol. Tierernährg. und Futtermittelkde 53: 193-199.
-	Müller, H.-M. og LeAn, C., 1988: Ergosterin als Mass für das Pilzwachstum in Futtermitteln. I Ergosteringehalt von Getreide. Arch. Anim. Nutr., Berlin, 38(3): 227-240.
-	Müller, H.-M. og Schwadorf, K., 1988: Ergosterin - ein Parameter zur quantitativen Bestimmung des Pilzbesatzes von Futtermitteln. Kraftfutter 5/88.
-	Müller, H.M. og Schwadorf, R., 1990: Ergosterin als Mass für das Pilzwachstum in Futtermitteln. 2. Ergosteringehalt von Mischfutterkomponenten und Mischfuttern. Arch. Anim. Nutr., Berlin, 40(4): 385-395.
-	Naewbanij, M., Seib, P.A., Burroughs, R., Seftz, L.M., og Chung, D.S., 1984: Determination of ergosterol using thin-layer chromatography and ultraviolet spectroscopy. Cereal Chem. 61(5): 385388.
-	Nes, W.R., Adler, J.R., SeNula. B.C. og Rrevitz, K., 1976: Discrimination between cholesterol and ergosterol by yeast membranes. Biochem. Biophys. Res. Comm. 71(4): 1296-1302.
-	Newell, S.Y., Arsufff, T.L. og Fallon, R.D., 1988: Fundamental procedures for determining ergosterol content of decaying plant material by liquid chromatography. Appl. Env. Microb. 54(7): 1876-1879.
-	Nout, M.J. R . , Laarhoven, T.M.G. Bonants van, Jongh, P. de og Koster, P. de, 1986: Ergosterol contents of Rhizopus oligosporus, NRRL 5905. Leaflet fra Microbe, 1986.
-	Offem, J.O. og Dart, R.R., 1982: Rapid method of estimating viable spores of aspergillus. J. Chromat. 249: 139-147.
-	Offem, J.O. og Dart, R.R., 1983: Rapid determination of spoilage fungi. J. Chromat. 260: 109-113.
-	Parks, L.W., Rodriguez, R.J. og Low, C., 1986: An essential fungal growth factor derived from ergosterol: A new end product of sterol biosynthesis in fungi? Lipids 21(1): 89-91.
-	Rao, B.S., Rao, V.S., Ramakrisna, Y og Bhat, R.V., 1989: Rapid and specific method for screening ergosterol as an index of fungal contamination in cereal grains. Food Chem. 31: 51-56.
-	Roberts, C.A., Moore, K.J., Graffis, D.W., Rirby, N.W. og Walgenbach, R.P., 1987: Quantification of mold in hay by Near Infrared Reflectance Spectroscopy. J. Dairy Sci. 70: 2560-2564.
-	Salmanowicz, B. og Nylund, J.-E., 1988: High performance liquid chromatography determination of ergosterol as a measure of ectomycorriza infections in Scots pine. Eur. J. For. Path. 18: 291-298.
-	Sashidhar, R.B., Sudershan, R.V., Ramakrishna, Y., Nabdi, S. og Bhat, R.V., 1988: Enhanced fluorescence of ergosterol by iodination and determination of ergosterol by fluorodensitometry. Analyst 113: 809-812.
-	Schwadorf, K. og M~ller, H.-M., 1989: Determination of ergosterol in cereals, mixed feed components and mixed feeds by liquid chromatography. J. Assoc. Anal. Chem. 72 (3): 457-462.
-	Seitz, L.M., Mohr, H.E., Burroughs, R. og Sauer, D.B., 1977: Ergosterol as an indicator of fungal invasion in grains. Cereal Chem. 54(6): 1207-1217.
-	Seitz, L.M. og PauRstelis, J.V., 1977: Metabolites of Alternaria alternata: Ergosterol and ergosta-4,6, 8(14), 22-tetraen-3-on. Agricult. Food Chem. 25(4): 838-841.
-	Seitz, L.M., Sauer, D.B., Burroughs, R., Mohr, H.E. og Nubbard, J.D., 1979: Ergosterol as a measure of fungal growth. Phytopatology 69: 1202-1203.
-	Seitz, L.M., Sauer, D.B. Mohr, H.E. og Aldis, D.F., 1982a: Fungal growth and dry matter loss during bin storage of high-moisture corn. Cereal Chemistry 59(1): 9-14.
-	Seitz, L. M., Sauer, D.B. og Mohr, H.E., 1982b: Storage of highmoisture corn: Fungal growth and dry matter loss. Cereal Chem. 59(2): 100-105.
-	Seitz, L.M., Mohr, H. E., Borroughs, R. og Gluack, J.A., 1983: Preharvest fungal invasion of Sorghum grain. Cereal Chem. 60(2): 127-130.
-	Seftz, L. M. og Pommeranz, Y., 1983: Ergosterol, ergosta-4,6,8 (14),22-tetraen-3-one, ergosterol peroxide and chitin in ergoty barley, rye and other grasses. J. Agric. Food Chem. 31(5): 10361038.
-	Seitz, L.M. og Bechtel, D.B., 1985: Chemical, physical and microscopical studies of scabinfected hard red winter wheat. J. Agric. Food Chem. 33(3): 373-377.
-	Sisler, H.D. og Ragsdale, N.N., ca. 1985: Biochemical and cellular aspects of the antifungal action of ergosterol biosynthesis inhibitors. Sci. publ. no. A3556. Contribution no. 6631 of the Univ. Maryland Agric. Exp. Station: 257-282.
-	Wefman, A.C.M. , Eijk, G.M. van, Winding, W. og Samson, R.A. , 1983: Modern detection methods for food spoilage fungi. I: King, A.D. Jr., Pitt, J. I., Beuchat, L. R. , Corry, J. E.L. : Methods for the mycological examination of food: 238-245.
-	Yang, S.-S. og Wang, N. -H., 1976: Determination of mycelial Steroids with the aid of polyene antibiotics. II. Quantitative determination of the mycelial steroids of Mucor hiemalis. Chinese J. of Microbiology 9: 19-30.
-	Young, J.C., Fulcher, R.G., Hayhoe, J.H., Scott, P.M. og Dexter, J. E. , 1984: Effect of milling and baking on deoxynivalenol (vomitoxin) content of eastern Canadian wheats. J. Agric. Food Chemistry 32: 659-664.
-	Young, J.C. og Miller, J.D., 1985: Appearance of fungus, ergosterol and fusarium mycotoxin in the husk, axial stem and stalk after ear inoculation of field corn. Can. J. Plant Sci. 65: 4753.
-	Zill, G., Engelhards, G. og Wallnöfer, P.R., 1988: Determination of ergosterol as a measure of fungal growth using Si 60 HPLC. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 187: 246-249.

Kilde:

Rapport nr. 91-2-4, 1991. Bioteknologisk Institut, Holdbergsvej 10, 6000 Kolding. Tlf. 75520433