Artikel: Influenza A virus i et zoonotisk perspektiv

Klassifikation og underinddeling af influenza

Influenzavirus tilhører Orthomyxoviridae familien, der er karakteriseret ved at have et segmenteret, negativt orienteret og enkeltstrenget RNAgenom indeholdt i en viruspartikel med en ydre kappe (Figur 1). Influenzavirus klassificeres som A, B eller C, og de kan adskilles på grundlag af deres morfologi og antigenforskelle i nukleoproteinet (NP) og matrixproteinet (M). Influenza A virus er yderligere opdelt i undertyper betinget af deres hæmaglutinin (HA) og neuraminidase (NA) antigener, der begge er udtrykt på overfladen af viruspartiklerne. Der findes 15 HA subtyper (H1- 15) og 9 NA subtyper (N1-9) af influenza A, og hver virus har ét HA og ét NA antigen. Næsten alle kombinationer af HA og NA er isoleret fra fugle, der kun inficeres med influenza af type A. I pattedyr er forekomsten af forskellige influenza A subtyper mere begrænset. Blandt mennesker er det kombinationer af H1, H2 og H3 samt N1 og N2, som har cirkuleret med H1N1, H2N2 og H3N2 som de absolut hyppigste subtyper. Svin er naturlige værter for H1 og H3 i kombination med N1 og N2, men kan i eksperimentelle infektioner både smittes med og udskille forskellige subtyper af fugle influenza A virus (3-5). De humane subtyper H3N2 og H1N1 kan også replikere i svin (1;5). To forskellige subtyper af influenza A er isoleret fra heste, nemlig H7N7 og H3N8 og de betegnes henholdsvis equin type 1 og 2 og ingen af dem replikerer i andre arter end hesten. For kvæg er serologisk påvist antistoffer mod influenza A virus (6), men influenza A virus er aldrig isoleret fra kvæg.

Nomenklatursystemet for influenzavirus inkluderer type, vært (bortset fra humane former), geografisk oprindelsessted, stamme nummer og årstal for isolation. HA og NA subtypen er angivet til sidst i parentes. [A/Ostrich/Denmark/72420/96 (H5N2) eller A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)].

Antigen drift

Influenza A virus har en formidabel evne til at akkumulere mutationer i genomet. Dette skyldes, at de virale enzymer, der katalyserer RNA syntesen (RNA afhængige RNA polymeraser) ikke er specielt præcise, når de katalyserer dannelsen af nyt RNA. Tilmed har de ingen indbygget rettefunktion, så et forkert indbygget nukleotid kan ikke rettes (7). Når mutationerne optræder i de områder af genomet, som koder for HA og NA er resultatet, at der gradvis selekteres virus med ændrede overfladeproteiner, der i stadig ringere grad genkendes og neutraliseres af værtens immunsystem. Det er en proces, der kaldes antigen drift, og selektionspresset gør HA og NA til de to mest variable proteiner hos influenza A virus (8). På grund af antigen drift forårsager de prævalente stammer af influenza A virus årlige epidemier i mennesker, selv om HA og NA sammensætningen er uændret. I den humane population cirkulerer der i øjeblikket to subtyper af influenza A (H1N1 og H3N2) og varianter af begge typer genereres hvert år ved drift. Derfor skal de humane vacciner opgraderes hvert år (9). For svin betinger den korte gennemsnitslevetid , at nye modtagelige populationer hele tiden er til stede. I disse kan der fremkomme gentagne udbud, også uden antigen drift i de cirkulerende virus stammer.

Antigen skift

En mere sjælden og dramatisk ændring af antigenegenskaberne af influenza A virus er antigenskift, der er et pludseligt og totalt skift i HA og/eller NA subtype (1;10).

Det segmenterede influenza A genom består af 8 RNA segmenter. Hvis en celle er samtidig inficeret med to influenza A subtyper, kan segmenterne kombineres næsten vilkårligt ved en proces, der kaldes genetisk reassortment. På den måde kan segmenterne, der koder for HA og/eller NA, blive sat sammen i en ny kombination og et nyt virus opstår med elementer fra begge de oprindelige virus, men som genotypisk og dermed immunologisk er helt forskellig fra dem (Figur 2). Svin er modtagelige for influenza A virus af både human og aviær oprindelse og kan derfor fungere som blandekar (Mixing vessel), hvormed nye virus kan opstå ved reassortment. Der er også rapporteret tilfælde af antigenskift mellem forskellige humane influenza A subtyper, hvis mennesker er inficeret med to subtyper på én gang (11).

1. Viruspartikler fra henholdsvis fugl og menneske hæfter til en grisecelle, der udtrykker specifikke glykoproteiner (sialyloligosaccerider) på overfladen.
2. Ved receptor medieret endocytos trænger viruspartiklen ind i værtscellen.
3. Ved en forsuring af det indre af endosoment smelter virusmembranen sammen med endosommembranen og genomkomplekserne (RNP) frigøres til cytosolen.
4. RNP transporteres ind i værtscellens kerne og nyt viralt mRNA og negativt orienteret genomisk RNA syntetiseres og (5) sendes på ny ud i cytosolen.
5. En blanding af fugle og mennesker afledte RNA genom segmenter pakkes ind i nye viruspartikler der afsnørres fra værtscellens ydre membran.
6. Nye infektiøse viruspartikler med overfladeproteiner fra fugle er resultatet.
7. Infektion af immunologisk naive mennesker med det nye virus.

Patogeniciteten af et virus, der er opstået ved et antigenskift, er uforudsigelig, idet det kan have mistet de nødvendige virulente determinanter, eller det kan have fuld virulens i kombination med et nyt overflade antigen. Tilmed kan den gradvis ændre virulens, mens den adapterer til en ny vært (7). Pandemier kan opstå, hvis reassortment medfører at virulens kombineres med evnen til at slå an, og det nye virus har antigener, som den humane population er immunologisk uforberedt på.

Fugle

Det blev først i 1955 opdaget, at aviær influenza skyldtes en virusinfektion. "Fowl plague", som det blev kaldt, viste sig at være høj-patogene former af aviær influenza, der havde dødelighedsrater på helt op til 100% i fjerkræ. I dag defineres høj-patogene former af aviær influenza A som HPAI (highly pathogenic avian influenza), mens lav-patogene stammer defineres som LPAI (low pathogenic avian influenza) (Council Directive 92/40/ECC af 19. maj 1992).

Aviær influenzainfektion hos fjerkræ kan optræde asymptomatisk, eller variere lige fra mild irritation af luftvejene til systemisk infektion med perakut, høj dødelighed. Klassifikationen af aviær influenza som enten HPAI eller LPAI er baseret på enten eksperimentel intravenøs inokulering af 6 uger gamle kyllinger, eller nukleotid sekventering af genomområdet, der koder for kløvningsstedet i det umodne HA protein. Sammensætningen af aminosyrer i kløvningsstedet af det umodne HA protein er nemlig en afgørende faktor for virulensen af aviære H5 og H7 influenza A stammer. Indtil nu har kun virus af H5 og H7 subtyperne været årsag til HPAI, men omvendt er ikke alle H5 og H7 virus virulente.

For de enkelte virusstammer gælder, at både graden af patogenicitet og værtsspecificitet kan variere. Ænder kan således være inficeret med aviære stammer af HPAI uden at udvise nogen form for symptomer, mens de samme virus er yderst patogene for kalkuner og kyllinger (12;13). Samtidig kan et skift i aviær værtstype være med til at frembringe nye virus, idet der sker en adaptation af virus i forhold til de forskellige værter (12;14). Ganske få nukleotidmutationer kan få enorm betydning, hvis de sker i regioner af influenza genomet, som er af betydning for patogeniciteten. Senest har Italien været ramt af en alvorlig aviær influenzaepidemi, som startede som en H7 LPAI blandt kalkuner. Fordi epidemien ikke kunne klassificeres som en HPAI, kom den ikke effektivt under kontrol og nye udbrud spredte sig ud over flere regioner i Norditalien, hvor der findes en stor fjerkræproduktion. Efter 9 måneder dukkede adskillige tilfælde af en H7 HPAI op, og inden for 3 måneder døde 13 millioner stykker fjerkræ af infektionen. Både kalkuner, kyllinger og vagtler blev ramt og døde af den nye H7 HPAI, der tilsyneladende var afledt af den oprindelige LPAI (12).

I Danmark har vi ikke haft udbrud af HPAI blandt fjerkræ. En enkelt H5 LPAI er blevet isoleret fra importerede strudse i karantæne (15), men ellers er der kun påvist subtyper forskellige fra H5 og H7 blandt vilde akvatiske fugle.

Svin

Svineinfluenza A blev første gang observeret i 1918 i USA, Ungarn og Kina, på samme tid som den spanske influenza hærgede den humane befolkning. Symptomerne lignende meget de, som blev observeret hos mennesker nemlig næseflåd, hoste, feber og dyspnoe (1;5). Først i 1930 blev viruset isoleret og identificeret som en influenza A. Svin inficeres naturligt med H1N1 og H3N2. Subtype H3N2 forårsager ikke så alvorlige symptomer som H1N1 og den form af H3N2, der p.t. cirkulerer overalt i verden er resultatet af et antigenskift mellem et fuglevirus og et humant virus, der begge cirkulerede i svin i 1979 (10). Ved rutinemæssig serologiske undersøgelser for svineinfluenzavirus foretaget på Statens Veterinære Institut for Virusforskning i 2000 var 89% af blodprøverne positive for subtype H1N1 og 53% var positive for H3N2. Undersøgelsen omfattede 1883 blodprøver udtaget fra ca. 150 besætninger (16). Svin udgør et stort reservoir for H1N1 og H3N2 influenza A virus og introduktion af nye virustyper fra andre arter gør svin til potentielle mellemled i udvekslingen af influenzavirus mellem arterne.

Heste

Influenza A virus blev først isoleret fra heste i 1956, men der har formodentlig været infektion af heste flere århundrede tidligere. Equine type 1 (H7N7) og equine type 2 (H3N8) forårsager begge tør hoste, feber, appetitløshed, muskelømhed og dyspnoe. H3N8 formodes at være af aviær oprindelse. Influenza A epidemier blandt heste er ikke sæsonrelateret men i højere grad afhængig af nærkontakt ved store stævner eller salgsarrangementer med heste (17).

Mennesker

De absolut hyppigste subtyper hos mennesket i øjeblikket er H1N1 og H3N2 og har tidligere været H2N2. Alle tre subtyper har været årsag til humane pandemier (Figur 3), og alle tre har i perioder været helt fraværende i den menneskelige befolkning. Den spanske influenza (H1N1) fra 1918 formodes udfra fylogenetiske studier at være af aviær oprindelse, idet alle 8 genomsegmenter var fugleafledte. Denne subtype variant cirkulerede fra 1918 til 1957, hvor den forsvandt eller blev fortrængt af H2N2 subtypen, der gav ophav til Asien pandemien i 1957. H2N2 subtypen indeholdt tre genom segmenter af aviær oprindelse, mens de resterende 5 segmenter stammede fra det allerede cirkulerende H1N1 virus. Den nye pandemiske influenzastamme var altså resultatet af genetisk reassortment, der gav et antigenskift. Det samme var tilfældet for Hong Kong pandemien i 1968, hvor 2 nye aviære genom segmenter blev mixet ind i H2N2 baggrunden og dermed gav ophav til H3N2. H2N2 forsvandt kort efter 1968. Fælles for pandemierne i 1957 og 1968 er, at de havde deres oprindelse i Sydøstasien, de havde signifikant forskellige antigener (HA) fra de influenzavirus, der på det pågældende tidspunkt cirkulerede, og de skyldtes begge genetisk reassortment, som gav et antigen skift. I 1977 dukkede H1N1 igen op som den russiske pandemi og tilmed i en nærmest fuldstændig identisk genotype til den, der forsvandt i 1957. Da influenza A virus hele tiden muterer, anses det for usandsynligt, at stammen har været bibeholdt i en dyrevært i mere end 20 år uden ændringer. Udslip fra et laboratorium eller overvintring i permafrost er foreslåede mekanismer for dens genkomst. Da den kun havde været væk i 20 år var en stor del af befolkningen immun overfor den, så dødsraten for den russiske pandemi var relativ lav, med undtagelse af de yngre befolkningsgrupper.

Ganske få tilfælde af andre influenza A undertyper er identificeret hos mennesker i løbet af de sidste 25 år. Tre enkeltstående tilfælde af øjenbetændelse hos mennesker har været forårsaget af infektion med H7N7 subtype af influenza A (18-20). Tilsvarende er seks tilfælde af H9N2 infektion hos børn med klassiske influenzalignende symptomer rapporteret (9;21;22). Ingen af disse har været i stand til at spredes mellem mennesker, ingen har forårsaget varige mén, og alle har været afledte fra aviære influenza A stammer.

I maj 1997 døde imidlertid en 3 årig dreng i Hong Kong efter at være inficeret med en H5N1 subtype af influenza A (23). Forløberen for den humane virusstamme viste sig at være en aviær influenza A, der tidligere på året havde forårsaget et omfattende udbrud af HPAI blandt fjerkræ. I november-december 1997 blev yderligere 17 mennesker diagnosticeret med H5N1 undertypen af influenza A, og 5 af dem døde efterfølgende. Smittevejen blev påvist til primært at være direkte overførsel af virus fra fugle til mennesker.

Reservoir af influenza A hos fugle

Det største naturlige reservoir af influenza A subtyper findes hos akvatiske fugle som ænder, gæs, terner og måger, idet alle 15 HA og 9 NA influenza A subtyper er påvist hos disse fugle. Ud fra fylogenetiske studier af influenza A virus er der rejst hypoteser om, at svømmefuglene er kilde til alle influenza A former hos andre arter (8;5) og det må anses for sandsynligt at en ny human pandemi kan opstå med bidrag fra nogle af disse aviære subtyper. De mulige mekanismer, der kan være involveret når en human pandemi opstår er følgende:

1. Antigen skift, hvor influenza A virus fra mennesker og fugle har inficeret den samme vært - sandsynligvis svin - og derfor har fået blandet genom segmenter (Asiatiske pandemi 1957 (H2N2), Hong Kong pandemi 1968 (H3N2)) (1).
2. Antigen drift, hvor et aviært influenza A virus er kommet ind i den humane population uden genetisk skift, men hvor virus forudgående har adapteret til mennesket ved genetisk drift i en anden pattedyrsmellemvært. Igen er svin spidskandidat (Spanske pandemi 1918 (H1N1)) (9;24).
3. Direkte overførsel og adaptation af hele virus fra fugle til mennesker (Hong Kong 1997 (H5N1) (25), virus kunne imidlertid ikke spredes mellem mennesker, så det blev ikke en egentlig pandemi) (8).
4. Genkomst af et virus, som har været årsag til pandemi mange år tidligere - enten ved laboratorieudslip eller ved overlevelse i fx permafrosten i og ved sibiriske søer (Russiske pandemi 1977 (H1N1)) (1;8).

Ingredienserne til en ny human influenza A pandemi findes uden tvivl i reservoiret hos de akvatiske fugle. Det vil imidlertid langt fra være alle punktmutationer og genetiske reassortment begivenheder, der vil kunne slå igennem i den humane befolkning og forårsage nye pandemier. Molekylære determinanter for overførselsmekanismerne mellem forskellige arter omfatter nøglesteder på især de to overfladeproteiner HA og NA. HA har en afgørende rolle ved genkendelse af værtscellen, idet HA fra de forskellige virus genkender forskellige sialyloligosaccerider. Her i ligger en medvirkende årsager til, at svin kan inficeres af både humane og aviære former for influenza A (10). For at en aviær influenza A type kan slå an i den humane befolkning kræves der, at den rumlige struktur af HA muliggør interaktion med de sialyloligosaccerider, der findes hos mennesket. Glykosyleringssteder på HA molekylet kan være af stor betydning i den proces, idet man har set eksempler på, at receptorbindingsstedet i HA bliver gjort tilgængeligt for andre sialyloligosaccerider end den fortrukne. Det sker, når aminosyrer udskiftes som følge af punktmutationer på nukleotid niveau, og glykosyleringssteder dermed går tabt (10). Mange barrierer skal overvindes, hvilket også illustreres af tilfældene i 1997 i Hong Kong. Selv om disse virus kunne inficere og replikere i mennesker, kunne de ikke spredes effektivt mellem mennesker. Hvis H5N1 stadig havde været tilstede i Hong Kong da de årligt tilbagevendende humane influenzaepidemier kom, ville der have været risiko for reassortment, hvis en human vært have været samtidig inficeret med en aviær og en human influenza A. En ny patogen virusstamme, der effektivt kunne spredes mellem mennesker, og som i kraft af antigenskift ikke var genkendelig for den humane befolkning, kunne være opstået. Heldigvis skete det ikke denne gang.

Overvågning og påvisning af influenza A

På baggrund af risikoen for at få en ny human pandemi af influenza A er interessen for overvågning og påvisning af influenza A virus i både mennesker og dyr øget. Den traditionelle influenza A isolation og opformering sker for aviære virus i embryonerede SPF hønse æg og for humane virus i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler eller tertiære abenyre celler (tMK). Begge metoder kræver tilstedeværelse af hele og infektiøse viruspartikler, og begge er tidskrævende. Et positivt resultat kan i bedste fald opnås inden for 48 timer, men et negativt udfald kan kræve subkultivering i op til 3 uger. Mindre tids- og ressourcekrævende påvisningsmetoder er derfor blevet udviklet og inkludere et bredt udvalg af strategier. Således kan tilstedeværelse af viralt antigen påvises med enzymatiske immuno-assays som fx ELISA, viralt inficerede celler kan påvises ved direkte immunofluorescenc og viralt RNA kan detekteres med “reverse transcription polymerase chain reaction” (RT-PCR). Serologiske tests, hvor påvisning af infektion er baseret på værtens immunrespons mod influenzavirus, indgår også i den virologiske diagnostik.

Påvisning af aviær influenza i Danmark

På Danmarks Veterinærinstitut testes i øjeblikket en RT-PCR metode til påvisning af den del af RNA virus genomet, der koder for nukleocapsid proteinet (NP). NP er velkonserveret blandt de mange forskellige influenza A stammer (26). Specificiteten af metoden er dokumenteret ved at undersøge 24 forskellige referencestammer af aviære influenza A og en række mammale influenza A virus. For at øge sensitiviteten og bekræfte specificiteten af NP RT-PCR metoden er der udviklet en ELISA, hvor produktet fra RT-PCR amplifikationen fanges med en intern probe. Inkluderingen af ELISA i detektionen øger følsomheden med op til 100 fold i forhold til almindelig RT- PCR med efterfølgende gel elektroforese (Figur 4).

Den tætte sameksistens mellem mennesker, svin og fugle i Asien formodes at være en afgørende faktor for, at mange influenza A epidemier og et par af pandemierne er opstået dér. Betingelserne for at få genetisk reassortment mellem influenza A virus stammer fra forskellige værter er formodentlig optimale under sådanne forhold. Ændrede produktionsformer her i Europa har også medført, at flere høns og svin har kontakt med den vilde fauna. Det er tænkeligt, at disse ændrede produktionsformer kan have indflydelse på muligheden for udveksling af influenza A virus mellem forskellige dyrearter og mennesket.

Så længe de molekylærbiologiske determinanter for effektiv transmission og replikation af fuglevirus i mennesker ikke er fuldstændig klarlagt, har man imidlertid ingen muligheder for at forudsige hvilke fugle influenza A stammer, der er eller kan blive særlig farlige for mennesker. Desuden er der kun begrænsede muligheder for at imødegå en pandemi, der allerede er startet. Vacciner tager tid at udvikle og der formodes at gå mindre end et halv år inden en pandemisk virus når hele verden rundt blandt andet som følge af den udbredte og globale flytrafik.

Øget kendskab til forekomst og hyppighed af influenza A virus hos de vilde svømmefugle er et af de tiltag i influenza overvågningen, som kan forbedre det veterinære beredskab og styrke fundamentet for risikovurdering. Som hjælp hertil er udvikling af hurtige og minimalt ressourcekrævende diagnostiske metoder nødvendige. Det er intentionen at forøge Danmarks Veterinærinstituts aktiviteter på disse områder fremover.