Actinobacillus pleuropneumoniae - nye aspekter i forskningen

Svinets ondartede lungesyge, der forårsages af infektion med A. pleuropneumoniae (Ap), forvolder fortsat betydelige sygdoms- og velfærdsproblemer samt økonomiske tab i svineproduktionen. En fjerdedel af de svin, der produceres i Danmark, har bemærkninger om pleuritis/pneumoni ved slagtning og Ap er ansvarlig for mindst halvdelen af dem (Mousing et al., 1990).

Sygdommen kan behandles med antibiotika, men under akutte udbrud forekommer ofte dødsfald inden en systematisk behandling indsættes, og problemerne i besætningerne bryder ofte ud igen når behandlingen seponeres. Efterhånden som antibiotikabehandlingens mulige bivirkninger bliver stadig tydeligere, bør alle kræfter samles om andre forebyggende tiltag imod sygdommen.

Der eksisterer sundhedsprogrammer til begrænsning af sygdommens udbredelse såsom SPF-systemer og ”segregated early weaning” i ”multisite” produktionssystemer. Ca. 25% af de danske slagtesvin og hovedparten af avlsdyrene bliver da også produceret i SPF programmet, mens systemer baseret på afbrydelse af smitte inden fravænning først er under opbygning under hensyntagen til dansk lovgivning. Disse programmer forudsætter effektive kliniske og laboratoriebaserede overvågningsredskaber.

A.pleuropneumoniae kan opdeles i biovar 1 og 2. Biovar 1 er den hyppigst isolerede i Danmark og behøver nicotinamid adenin dinukleotid (NAD) for at vokse. NAD-behovet kan fx tilgodeses ved at lungemateriale sås ud på blodagar, hvor der bagefter udstreges en ammekultur af E. coli. Ap biovar 1 vokser som små hæmolytiske kolonier omkring ammekulturen. Biovar 2 er uafhængig af NAD og vokser med større hæmolytiske kolonier uafhængigt af ammekulturen. Biovar 2 regnes som mindre virulent end biovar 1 (Frey, 1995; Jacobsen et al., 1996).

Traditionelt foretages dyrkninger fra læsioner i lungevævet. Pharynx-tonsillerne udgør imidlertid et vigtigt reservoir for Ap i subklinisk inficerede svin (Nielsen, 1995). I danske undersøgelser er der ved dyrkning påvist en prævalens af Ap i tonsiller på henholdsvis 42% og 23% hos slagtesvin fra konventionelle besætninger (Møller, 1993; Jacobsen & Nielsen, 1995). Den høje prævalens samt det forhold at Ap i visse tilfælde kan påvises i tonsiller hos dyr, der ikke har serokonverteret, gør tonsilundersøgelser til et vigtigt diagnostisk supplement til serologisk undersøgelse. Da tonsillerne udgør et stærkt kontamineret miljø er der på SVS udviklet forbedrede selektive medier til dyrkning (Jacobsen & Nielsen, 1995). På det selektive og indikative medium, der anvendes efter aftale ved undersøgelse af tonsiller, kan Ap påvises som hæmolytiske grå kolonier efter 24 timers inkubation.

Tonsildiagnostikken anvendes fx i forbindelse med reinfektioner i SPF-besætninger, hvor der er mistanke om subklinisk infektion. Metodens relevans er især stor i de meget belastende salgsstopsituationer, hvor der findes serologiske reagenter, uden at der ses kliniske tegn. I de tilfælde hvor der foreligger akutte lungeforandringer, vil dyrkning fra disse læsioner normalt være tilstrækkeligt til agenspåvisning.

I forbindelse med undersøgelse af tonsilmateriale kan sensitiviteten forbedres ved anvendelse af den genteknologiske metode polymerase chain reaction (PCR). Hidtil er der på SVS udviklet og evalueret to PCR-test til diagnostik af Ap. I første omgang blev to primere fra en funktionelt ukendt DNA-sekvens fra Ap undersøgt (Gram et al., 1995). Tonsiller fra 101 slagtesvin blev undersøgt med denne PCR og 65% blev fundet positive. Til sammenligning kunne Ap isoleres fra 23% af tonsillerne ved dyrkning.

Som følge af problemer med uspecifikke amplifikationsprodukter blev udviklingen af en PCR-test fortsat med flere forskellige grupper af gener. Kun PCR-primere baseret på et gen, som koder for et membranlipoprotein (OmlA) viste sig at være anvendelige til diagnostik af Ap (Gram & Ahrens, 1996). Den nye PCR-test blev afprøvet på et panel af beslægtede bakterier, og viste sig at være specifik for Ap. Specificiteten blev desuden undersøgt ved PCR-testning af 50 tonsilprøver fra en SPF-avlsbesætning, der alle viste sig PCR negative. Ved en undersøgelse af 101 blandingskulturer fra tonsiller var 57% positive i PCR testen, mens kun 23% var positive ved dyrkning. Testen afprøves i øjeblikket med henblik på at undersøge, om den egner sig til at blive appliceret i den rutinemæssige diagnostik på SVS.

Serotyper

Varmestabile overfladeantigener af polysakkarid- og lipopolysakkarid-natur danner grundlaget for den serologiske typning, hvorved der kan skelnes 12 serotyper af biovar 1. Serotype 5 er yderligere inddelt i 5a og 5b. Serotype 2 er den hyppigst forekommende i Danmark, fulgt af serotype 6 og serotype 5. Isolater af biovar 2 (ikke NAD-afhængig) lader sig som regel type indenfor dette serotypningssystem (Tabel 1). Yderligere serotyper er imidlertid beskrevet for nogle biovar 2 isolater (Fodor et al., 1989; Nielsen et al., 1997) og disse er foreslået benævnt som serotype 13 og 14.

Tabel 1.

Toksinmønster hos A.pleuropneumoniae’s serotyper

Toksin mønster	Serotype biovar 1	ApxI	ApxII	ApxIII
1	1, 5a, 5b, 9, 11	+	+	-
2	2, 4, 6, 8	-	+	+
3	3	-	+*	+
4	7, 12	-	+	-
5	10	+	-	+
Toksin mønster	Serotype bivar 2	ApxI	ApxII	ApxIII
1	9	+	+	-
4	2, 4, 7	-	+	-
5	14	+	-	+
* Serotype 3 har gener for produktion af både ApxII og ApxIII, men udskiller kun ApxlIII da den mangler genet for ekskretion af ApxlII (som derved forbliver intracytoplasmatisk)

Der er forskel i virulensen imellem og indenfor serotyperne. Herhjemme er set alvorlige sygdomsudbrud med høj mortalitet og omfattende lungelæsioner efter infektion med serotype 2, 5 og 8, men disse infektioner kan også have et mere mildt forløb i besætningerne. Der er også forskelle landene imellem i den rapporterede virulens af de forskellige serotyper (Frey, 1995).

Ved SVS foregår den rutinemæssige serotypning ved hjælp af latexagglutination, hvor kaninsera mod de forskellige serotyper er bundet til latexpartikler. Renkulturer af Ap bliver opslæmmet i en dråbe coatede latexpartikler på objektglas og positiv reaktion viser sig ved en synlig agglutination med det homologe antiserum. Cirka 90% af isolaterne lader sig type på denne måde. Dyrkning, serotypning og resistensbestemmelse varer normalt ca. 1 uge. I ca 10% af tilfældene bevirker serologiske krydsreaktioner at typebestemmelsen ikke kan foretages ved denne rutinemetode og alternative metoder må tages i anvendelse. Til dette benyttes geldiffusion og indirekte hæmagglutination (IHA). I sådanne tilfælde vil serotypebestemmelsen vare ca. 2 uger.

Serotypning er et vigtigt epidemiologisk redskab i forbindelse med overvågning og kontrol af ondartet lungesyge. I de seneste år er serotypningen suppleret med et ribotypningssystem. Bortset fra serotype 5a/5b samt serotype 9/11 kan ribotypning adskille eller underopdele de beskrevne serotyper og således bruges som epidemiologisk markør. Dette system har været anvendt til opklaring af smitteveje ved infektion i SPF-besætninger (Fussing et al., 1996). Andre alternativer til den traditionelle serotypning er også under overvejelse. En nærliggende mulighed er at udvikle tests, der direkte påviser tilstedeværelsen af generne for dannelse af de forskellige kapseltyper ved hjælp af polymerase chain reaction (PCR). En række PCR-test er udviklet med henblik på påvisning af de tre Apx-toksiner (se næste afsnit) hos isolater fra Ap. På baggrund af Apx-toksingener kan Ap serotyperne opdeles i 5 forskellige toksinmønstre (Tabel 1). Derudover er der ved sekventeringen af OmlA-genet for Ap serotyperne påvist en variabilitet der har muliggjort en opdeling af serotyperne i 4 forskellige OmlA-grupper baseret på PCR. Ved en kombination af PCR-test for Apx-toksiner og OmlA-gener kan alle serotyper, der forekommer i Danmark, pånær serotype 6 og 8, adskilles. Herved er der tilvejebragt en metode til virulensfaktor karakterisering af Ap isolater, som et alternativ til serotypning. UndersØgelser af virulensfaktor-typning fortsættes med henblik på vurdering af stabiliteten i en stØrre kollektion af Ap isolater.

Virulensfaktorer

A. pleuropneumoniae´s virulens er bestemt af mange forskellige faktorer heriblandt Apx-toksiner, kapselpolysakkarider, lipopolysakkarider, membranproteiner og adhæsionsfaktorer, men der er ikke identificeret en enkelt faktor som kan føre til dannelse af beskyttende immunitet ved vaccination (Fedorka-Cray et al., 1993). Virulensforskelle mellem serotyper er en almindelig klinisk iagttagelse. Ved standardiserede aerosolpodninger er virulensen hos Ap serotype 2, 5b og 6 sammenlignet, uden at der kunne påvises klare forskelle (Jacobsen et al., 1996). Derimod var virulensen af et undersøgt biovar 2 isolat stærkt reduceret i forhold til de øvrige. Præliminære resultater fra podning med Ap serotype 12 tyder også på reduceret virulens hos denne serotype.

Bakteriens kapsel er en vigtig virulensfaktor, idet kapselløse mutanter har reduceret virulens. Det er sandsynligvis kapslens evne til at beskytte og “skjule” bakterien for svinets immunsystem der bidrager til bakteriens overlevelsesevne. Passiv immunisering af grisene med antistoffer mod kapselpolysakkarider er således ofte ikke beskyttende (Inzana et al., 1988). En anden kulhydratkomponent i bakteriens overflade, det såkaldte lipopolysakkarid har vist sig at have betydning for bakteriens adhæsion til værtsepithelet (Belanger et al., 1990; Paradis et al., 1994). Lipopolysakkaridet er stærkt immunogent og inficerede svin har normalt antistoffer mod lipopolysakkarid-antigenerne.

Foruden kulhydratkomponenterne findes der i bakteriens overflade membranproteiner. Blandt de mere velkarakteriserede af disse proteiner findes transferrinbindende proteiner, som er af essentiel betydning for bakteriernes jernforsyning. I modsætning til lignende transferrinbindende proteiner hos andre Gram-negative svinepatogener er Ap’s transferrinbindende protein bemærkelsesværdigt ved udelukkende at binde transferrin fra svin og ikke fra andre dyrearter.

Exotoksiner er betydningsfulde virulensfaktorer hos Ap. Der er beskrevet tre protein-toksiner, som benævnes ApxI, ApxII og ApxIII. Disse toksiner er poreformende cytolytiske proteiner, der i oprenset form er i stand til at fremkalde kliniske symptomer og lungelæsioner, typisk for Ap-infektion. De forskellige toksiner besidder hæmolytisk og cytotoksisk aktivitet overfor fagocyterende celler i varierende grader, således er ApxI stærkt hæmolytisk og cytotoksisk, ApxII er svagt hæmolytisk og moderat cytotoksisk og ApxIII er nonhæmolytisk, men stærkt cytotoksisk. Referencestammerne af de forskellige Ap serotyper kan inddeles i 5 toksinmønstre (Tabel 1). De fleste undersøgte felt-isolater følger reference-stammernes toksinmønster, dog er der nogle som afviger (Beck et al., 1994).

Grundet virulensfaktorernes mere eller mindre specifikke egenskaber i relation til sygdomspatogenesen påkalder virulensfaktorerne sig en betydelig immunologisk interesse både hvad angår muligheder for vaccination, men i lige så høj grad i forbindelse med udvikling af praktisk relevante serodiagnostiske tests.

Serologisk diagnostik

På SVS er der udviklet serotypespecifikke serologiske metoder, fortrinsvis komplementbindingsmetoder, der hidtil har været benyttet som redskaber i overvågningen af SPF-programmet. I de senere år er to af disse, serotype 2 (Nielsen et al., 1991; Sørensen et al., 1996) og serotype 8 (Nielsen et al., 1993), blevet erstattet af polyklonale blokerings ELISA’s med højere sensitivitet. Tilsvarende ELISA’s er under udvikling for serotype 5 og 6.

I samarbejde med Danske Slagterier og Den Kgl. Veterinær og Landbohøjskole arbejdes der på SVS til stadighed med optimering af de serologiske metoders sensitivitet og specificitet og med de epidemiologiske metoder til bestemmelse af disse testkarakteristika.

Monoklonale antistoffer, både overfor serotype 2 (Stenbæk & Shirmer, 1994) og serotype 5 (Klausen et al., 1996), har været forsøgt anvendt til dette formål, men indtil videre vist sig mindre egnede da variationer indenfor den enkelte serotype bevirker, at infektioner med visse Ap-stammer af samme serotype ikke kan påvises. Mere højspecifikke serologiske teknikker forsøges nu udviklet, blandt andet ved anvendelse af specifikke rekombinante antistoffer, samt monoklonale antistoffer fremstillet ved heterohybridomteknik. Brugen af monoklonale antistoffer i blokerings-ELISA har været baseret på specifikke forskelle i lipopolysakkarid og kapselantigener mellem de forskellige serotyper og har derfor en høj specificitet. Sensitiviteten har desværre vist sig at være for lav. Ved konventionel hybridomteknik fremstilles de antistofproducerende hybridomer ved en fusion mellem en musemyelomcelle og en miltcelle fra immuniserede mus, og er derfor baseret på et museantistof-repertoire. Ved heterohybridomteknikken er udgangspunktet en immunisering af den naturlige vært, svinet. Musemyelomceller fra svinet bliver fusioneret med miltceller fra svin og den dannede heterohybridomcelle vil derfor producere svineantistoffer. Metoden har den fordel, at de fremstillede antistoffer i højere grad korresponderer med de antistoffer der naturligt findes i inficerede svin og derfor burde være mere egnede i blokerings-ELISA.

Ap’s ydre membranproteiner er også interessante i forbindelse med serologisk diagnostik, da de ofte inducerer antistofdannelse. Da det transferrinbindende protein hos Ap udelukkende binder transferrin fra svin, er der en teoretisk mulighed for at kunne producere diagnostiske antistoffer, der er rettet mod Ap-specifikke områder på dette protein, med henblik på udvikling af en Ap-specifik serologisk test på tværs af serotyperne (Heegaard et al., 1996). På SVS arbejdes der også med adskillige andre ydre membranproteiner med potentiale som “fælles” Ap-antigener.

Det grundlæggende problem ved en “bred” test er, at man skal finde antigener som er helt specifikke for Ap, som findes hos alle Ap-serotyper og som giver anledning til et brugbart og reproducérbart antistofsvar hos alle inficerede dyr.

Undersøgelser af mulighederne for at foretage serologisk diagnostik baseret på antistoffer rettet imod Apx toksinerne er også iværksat. Foreløbige resultater viser, at det bliver nødvendigt at udvikle specifikke reagenser, som er rettet imod Ap-specifikke områder på toksinerne, der også findes i næsten samme form hos andre Gram-negative svinepatogener. I USA benyttes en metode, der er baseret på serumneutralisation af den hæmolytiske effekt af toksinerne, til besætningsprofilering i forbindelse med ”segregated early weaning” (Fenwick et al., 1996). Ved denne metode er det kun negative resultater, der umiddelbart kan fortolkes, idet positive resultater også kan skyldes respons på toksiner fra Actinobacillus suis, Escherichia coli eller Proteus vulgaris.

Traditionelt har der været anvendt bacteriner til vaccination imod Ap. Ap-bacteriner er vacciner baseret på dræbte, vaskede helcellepræparationer af en eller flere serotyper. Disse bacteriner har ofte beskyttende effekt overfor mortalitet, men begrænset effekt overfor lungelæsioner. Der har været konstateret partiel beskyttelse overfor infektion med den homologe serotype, men ikke overfor heterologe serotyper, som det ses ved naturlig infektion (Nielsen, 1976; Nielsen, 1984). Der har flere steder været arbejdet med at udvikle bedre og bredt dækkende vacciner imod Ap-infektioner hos svin.

Ved SVS har der i perioden 1992-1995 med finansiel støtte fra Danske Slagterier været arbejdet med udvikling af en kapselpolysakkarid konjugat vaccine (Andresen, 1994). Kapselpolysakkarid hos Ap er en vigtig virulensfaktor, som har vist sig at hæmme både den bakteriocide effekt af serum in vitro og fagocytose af bakterien (Inzana et al., 1988). Kapselpolysakkarid er i sig selv ikke særlig immunogent, men ved kobling af polysakkarid til et immunogent bærer-molekyle som for eksempel tetanus toxoid kan polysakkaridets immunogene egenskaber ændres. Forsøg udført ved SVS har vist, at det var muligt at opnå et kraftigere antistofrespons over for kapselpolysakkarid fra Ap serotype 5b ved konjugering af kapselpolysakkarid til tetanus toxoid, og at der kunne opnås en vis beskyttelse over for challenge med Ap serotype 5b ved immunisering af grise med et kapselpolysakkarid-tetanus toxoid konjugat fra samme serotype. Det måtte imidlertid konstateres at et Ap-kapselpolysakkarid konjugat ikke alene kunne give fuld beskyttelse overfor eksperimentel infektion med Ap, men at et kapselpolysakkarid konjugat kunne være en del af en subunit vaccine suppleret med andre komponenter fra Ap.

Andre steder har man arbejdet med andre virulensfaktorer hos Ap, blandt andet Apx-toksinerne i kombination med ydremembran proteiner (Van den Bosch et al., 1992; Rossi-Campos et al., 1992). Disse subunit vacciner har været afprøvet overfor eksperimentel challenge med gode resultater med hensyn til beskyttelse imod mortalitet. Der er dog endnu ikke nogen vacccine, der har givet fuld beskyttelse over for lungelæsioner i infektionsforsøg.

En avirulent mutant af Ap serotype 5, som ikke secernerede ApxI og ApxII, gav ingen beskyttelse imod infektion med den homologe vildtype stamme (Inzana et al., 1991), hvilket demonstrerer betydningen af toksinerne i induktionen af beskyttende immunitet. I modsætning hertil inducerede vaccination med en ikke-kapseldannende mutant af Ap serotype 5 (Inzana et al., 1993), antistoffer imod toksinerne og beskyttede imod klinisk sygdom ved podning med den virulente homologe serotype 5 stamme. Disse forsøg indicerede at ApxI og/eller ApxII er nødvendige omend ikke sufficiente for induktion af beskyttende immunitet imod Ap serotype 5. De forsøg der har været udført med subunit vacciner imod Ap indicerer, at det er nødvendigt med et antal forskellige komponenter i vaccinen for at give beskyttelse imod flere serotyper samtidigt.

En kommerciel vaccine (Porcilis APP, Intervet) baseret på ApxI, ApxII, ApxIII og et ydre membran protein fælles for alle serotyperne, anvendes for tiden på dispensation i Danmark og søges registreret. Vaccinen er fremstillet med henblik på beskyttelse imod alle serotyper af Ap (Kobisch & Van den Bosch, 1992; Van den Bosch et al., 1994; Pommier et al., 1996; Valks et al., 1996).

Foreløbige erfaringer tyder på at ca 10% af grise, vaccineret med denne vaccine, responderer serologisk imod Ap serotype 2 i den polyklonale blokerings-ELISA. Dette skyldes formentligt, at vaccinen indeholder kapselkomponenter fra serotype 2. Besætninger, der benytter vaccinen, kan derfor ikke forventes at kunne deklareres fri for serologiske reagenter overfor Ap serotype 2.

Andresen, L.O.:Forskningsprojekt om ny vaccine mod ondartet lungesyge. VeterinærInformation. 1994, 1: 8-10.

Beck, M., Van den Bosch, J.F., Jongenelen, I.M.C.A., Loeffen, P.L.W., Nielsen, R., Nicolet, J., Frey, J.: RTX toxin genotypes and phenotypes in Actinobacillus pleuropneumoniae field strains. J.Clin.Microbiol.1994, 32: 2749-2754.

Belanger, M., Dubreuil, D., Harel, J., Girard, C., Jacques, M.: Role of lipopolysaccharides in adherence of Actinobacillus pleuropneumoniae to porcine tracheal rings. Infect.Immun.1990, 58: 3523-3530.

Fenwick, B., Harris, D.L., Rider, M., Chengappa, M.:Eradication of Actinobacillus pleuropneumoniae by early segregated weaning: Lessons learned and potential applications for the control of other HAP group organisms.Proceedings, HAP Conference, Acapulco, Mexico. 1996, 24.

Fedorka-Cray, P.J., Stine, D.L., Greenwald, J.M., Gray, J.T., Huether, M.J., Anderson, G.A.: The importance of secreted virulence factors in Actinobacillus pleuropneumoniae bacterin preparation: a comparison. Vet.Microbiol. 1993, 37: 85-100.

Fodor, L., Varga, J. Molnar, E. Hajtos, I.: Biochemical and serological properties of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 strains isolated from swine. Vet.Microbiol. 1989, 20: 173-180.

Frey, J.: Virulence in Actinobacillus pleuropneumoniae and RTX toxins. Trends in Microbiology. 1995, 3: 257-261.

Fussing, V., Nielsen, R., Barfod, K., Nielsen, J.P.: A ribotypning system for epidemiological studies of Actinobacillus pleuropneumoniae strains from infected Danish SPF-herds. Proceedings, IPVS congress, Bologna, Italy. 1996, 196.

Gram, T., Ahrens, P., Nielsen, J.P.: Evaluation of a PCR for detection af Actinobacillus pleuropneumoniae in mixed bacterial cultures from tonsils. Vet.Microbiol. 1995, 51: 95- 104.

Gram, T., Ahrens, P.: Development of a polymerase chain reaction assay for detection of A.pleuropneumoniae. Proceedings, HAP Conference, Acapulco, Mexico. 1996, 41.

Gram, T., Jacobsen, M.J., Ahrens, P., Nielsen, J.P.: Diagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae in tonsils by culture and polymerase chain reaction. Proceedings, IPVS Congress, Bologna, Italy. 1996, 186.

Heegaard, P., Bøg, Y.S., Klausen, J., Andresen, L.O., Nielsen,R.: The use of synthetic peptides corresponding to antigenic, shared linear stretches of Actinobacillus pleuropneumoniae transferrin binding protein type 2 in a serotype independent species-specific assay for Actinobacillus pleuropneumoniae. Proceedings, HAP conference, Acapulco, Mexico. 1996, 25.

Inzana, T.I., Ma, J., Workman, T. Gogolewski, Anderson, P.: Virulence properties and protective efficacy of the capsular polymer of Haemophilus (Actinobacillus) Pleuropneumoniae serotype 5.Infect.Immun. 1988, 56: 1880-1889.

Inzana, T.J., Todd, J., Veit, H.: Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection. Microb.Pathogen. 1991, 10: 281-296.

Inzana, T.I., Todd, J. and Veit, H.P.: Safety, stability and efficacy of noncapsulated mutants of Actinobacillus pleuro pneumoniae for use in live vaccines. Infect.Immun. 1993, 61: 1682-1686.

Jacobsen, M.J., Nielsen, J.P.: Development and evaluation of a selective and indicative medium for isolation of Actinobacillus pleuropneumoniae from tonsils. Vet.Microbiol. 1995, 47: 191-197.

Jacobsen, M.J., Nielsen, J.P., Nielsen, R.: Comparison of virulence studies of Actinobacillus pleuropneumoniae using a standardized aerosol infection model. Vet.Microbiol. 1996, 49: 159-168.

Klausen, J., Andresen, L.O., Heegaard, P., Nielsen, J.P., Nielsen, R.: Evaluation of blocking ELISAs for serodiagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5 infections based on monoclonal antibodies against capsular polysaccarides and LPS as well as swine-mouse heterohybridoma-derived monoclonal antibodies. Proceedings, HAP Conference, Acapulco, Mexico. 1996, 40.

Kobisch, M. and van den Bosch, J.F.: Efficacy of an Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine. Proceedings, IPVS, the Haag, the Netherlands. 1992, 216.

Mousing, J., Lybye, H., Barfod, K., Meyling, A., RØnsholt, L., Willeberg, P.: Chronic pleuritis in pigs for slaughter: an epidemiological study of infectious and rearing system-related risk factors. Prev.Vet.Med. 1990, 9: 107-119.

Møller, K.: Optimalization of the detection of NAD dependent Pasteurellaceae from the respiratory tract of slaughterhouse pigs. Vet.Microbiol. 1993, 36: 261-271.

Nielsen, J.P.: Atropic rhinitis and Actinobacillus infections. Proceedings, World Veterinary Congress, Yokohoma. 1995, 1-18.

Nielsen, R.: Pleuropneumonia of swine caused by Haemophilus pleuropneumoniae: studies on the protection obtained by vaccination. Nord.Vet.Med. 1976, 28: 337-348.

Nielsen, R.: Haemophilus pleuropneumoniae serotypes - cross protection experiments. Nord.Vet.Med. 1984, 36: 211-234.

Nielsen, R., Plambeck, T., Foged, N.T.: Blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to Actinobacillus pleuropneumoniae Serotype 2. J.Clin.Microbiol. 1991, 23: 794-797.

Nielsen, R., Plambeck, T., Foged, N.T.: Blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 8. Vet.Microbiol. 1993, 34: 131-138.

Nielsen, R., Andresen, L.O., Plambeck, T., Nielsen, J.P., Krarup, L.T., Jorsal, S.E.: Serological characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype 2 strains isolated from pigs in two Danish herds. Vet.Microbiol. 1997, 54: 35-46.

Paradis, S.-E., Dubreuil, D., Rioux, S., Gottschalk, M., Jacques, M.: High-molecular-mass lipopolysaccharides are involved in Actinobacillus pleuropneumoniae adherence to porcine respiratory tract. Inf.Immun. 1994, 62: 3311-3319.

Pommier, P., Ridremont, B., Wessel-Robert, S., Keïta, A.: Field study into efficacy of a new Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine. Proceedings, IPVS, Bologna, Italy. 1996, 206.

Rossi-Campos, A., Anderson, C., Gerlach, G.-F., Klashinsky, S., Potter, A.A., Willson, P.J.: Immunization of pigs against Actinobacillus pleuropneumoniae with two recombinant protein preparations. Vaccine. 1992, 10: 512-518.

Stenbæk, E.I., Schirmer, A.L.: Detection of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 antibodies in pig sera by an inhibition enzyme immuno assay (EIA). 1994. Vet.Microbiol. 1994, 39: 231-244.

Sørensen, V., Barfod, K., Nielsen, J.P., Feld, N.C., Christensen, J.: An evaluation of a polyclonal blocking ELISA and a complement fixation assay detecting antibodies to Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2. Proceedings, IPVS Congress, Bologna, Italy. 1996, 191.

Valks, M.M.H., Nell, T., van den Bosch, J.F.: A clinical fieldtrial in finishing pigs to evaluate the efficacy of a new App subunit vaccine. Proceedings, IPVS, Bologna, Italy. 1996, 208.

Van den Bosch, J.F., Pubben, A.N.B., Jongenelen, I.M.C.A., Segers, R.P.A.M.: An Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine inducing protection in pigs against all serotypes. Proceedings, HAP Conference, Edinburgh, Scotland, 1994, 55.

 

Van den Bosch, J.F., Jogenelelen, I.M.A.C., Pubben, A.N.B., Vugt, F.G.A., Segers, R.P.A.M.: Protection induced by a trivalent A.pleuropneumoniae subunit vaccine. Proceedings, IPVS Congress, The Haag, the Netherlands. 1992, 194.

Kilde: Dansk Veterinærtidsskrift nr. 7, 1. april 1997, 80. årgang side 284-287