Projektet: “Forbedring af befrugtningsevnen ved inseminering hos kvæg og svin” (sædprojektet) blev påbegyndt i 1995. Formålet med projektet er at udvikle, afprøve og igangsætte anvendelsen af nye metoder til vurdering af sædkvalitet. Projektets mål er dels at forbedre de eksisterende metoder, dels at udvikle nye tests til undersøgelse af vigtige sædcelle funktioner. Et vigtig led i metodeudviklingen er at tests bliver baseret på anvendelse af flowcytometri. Denne teknik indebærer, at et stort antal sædceller (10.000 eller mere) kan analyseres på under ét minut. Flowcytometrien kan således bidrage med en øget præcision i sædanalyserne.
Sædprojektet er finansieret af danske kvægavlsforeninger og ornestationer samt via udviklingsstøtte fra Strukturdirektoratet under Fødevareministeriet. Projektets årlige budget er på 2,5 mill. kr.
Det forventes, at sædprojektets resultater vil bidrage til en bedre overvågning af sædkvaliteten indenfor kvægavlen og svineproduktionen. En forbedring af frugtbarheden ved inseminering forventes at have en stor praktisk og økonomisk betydning for dansk husdyrproduktionen.
Summary
The project: “Improvement of fertility after insemination in cattle and pigs” (The semen project) was initiated in 1995. The overall aim of the project is to develop, test and apply new methods for evaluation of semen quality. This objective will be achieved through improvement of the present techniques but also by development of new tests for investigation of spermatozoal function. An important new technique is the use of flow cytometry. Flow cytometry makes it possible to analyze a large number of spermatozoa (10,000 or more) within one minute and are therefore likely to increase precision of analyses.
The semen project is financed by the Danish AI societies for cattle and pigs and by The Danish Directorate for Development, Ministry of Food, Agriculture and Fisheries. The annual budget for the project is 2.5 mill. Dkr.
It is expected that the results obtained will lead to development of techniques that allows for a better control of the quality of the semen used for insemination in cattle and pig production. An improvement of reproductive efficiency after insemination in cattle and pigs will have significant practical and economical impact on Danish domestic animal production.
Baggrund for projektet
Inseminering i kvægbruget benyttes i dag til ca. 85% af alt kvæg (ca. 850.000 dyr pr. år). Den gennemsnitlige ikke-omløber procent ved 56 dage ligger på omkring 65% på landsplan, men kun 40-45% af insemineringerne resulterer i en født kalv.
I svinesektoren anvendes insemineringen i stigende omfang, pt. udføres ca. 700.000 insemineringer på årsbasis svarende til ca. 37% af alle løbninger. Antallet af insemineringer, som resulterer i drægtigheder er tilfredsstillende (80-90%). Derimod er der en betydelig variation i kuldstørrelsen imellem ornerne, som i gennemsnit på landsplan er ca. 11,2 grise/kuld.
Sædproduktionen på tyre- og ornestationerne omfatter på årsbasis ca. 75.000 sædopsamlinger (figur 1). For tyrenes vedkommende bliver ca. 12% af de i alt 13.000 ejakulater efterfølgende kasseret og de resterende ca. 11.500 ejakulater bliver fortyndet og nedfrosset. Kvalitetskontrollen efter optøning omfatter vurdering af motiliteten i to strå pr. ejakulat (ca. 23.000 strå), og ca. 5% af ejakulaterne kasseres som følge af utilfredsstillende motilitet efter optøning. For ornesædens vedkommende bliver ca. 5% af de i alt 62.000 ejakulater kasseret og de resterende ca. 59.000 ejakulater fortyndes og opbevares ved 18 °C, da ornesæd er meget følsom for nedkøling og frysning. Kvaliteten af den fortyndede ornesæd kontrolleres efter 24 timer (10% af alle ejakulater) og 72 timer (5% af alle ejakulater). Den fortyndede ornesæd anvendes almindeligvis kun til inseminering i de første 3 dage efter opsamlingen.
De vigtigste parametre i undersøgelsen af tyre- og ornesæd er bestemmelse af sædkoncentration og vurdering af sædens motilitet. Sædkoncentrationen bestemmes i reglen ved anvendelse af fotometer (der anvendes IMV fotometer til tyresæd og Corning 252 fotometer til ornesæd). Denne metode er noget usikker, især hvad det angår ornesæd. Motiliteten vurderes ved en subjektiv mikroskopisk bedømmelse, og der kan være stor forskel i vurderingen fra station til station. Morfologien af sæden undersøges oftest kun i forbindelse med motilitetsvurderingen, idet sæd med særlig afvigende morfologi noteres og eventuelt kasseres. Sammenhængen imellem frugtbarheden ved insemination og parametrene koncentration, motilitet og morfologi er imidlertid ikke tilfredsstillende. Parametrene kan ganske vist anvendes til at kassere sæd af ringe kvalitet, men der kan ikke skelnes imellem sæd af høj og middel befrugtningsevne. Sædprojektets mål er derfor dels at forbedre præcisionen ved de eksisterende metoder samt udvikle nye (supplerende) metoder, således at sædens befrugtningsevne bedre kan forudsiges efter en laboratorie undersøgelse.
Forud for sædprojektets start i maj 1995 blev der gennemført et forprojekt til afklaring af behovet for en forskningsindsats, samt hvilke områder der ville være aktuelle for dansk kvægavl og svineproduktion. Resultatet af dette forprojekt er sammenfattet i en rapport (Johansen og Christensen, 1994) og dannede basis for det efterfølgende projekt.
Figur 1. Figuren viser i hovedtræksædproduktionen på danske tyre- og ornestationer. Der opsamles på årsbasis i alt ca. 75.000 ejakulater, og sædkvaliteten vurderes på alle ejakulater. Desuden vurderes kvaliteten af mindst 23.000 optøede strå (fra tyre) og mindst 9.000 fortyndede ejakulater (fra orner). Insemineringsarbejdet er ligeledes omfattende og på årsbasis insemineres ca. 2 mill. dyr.
International sædforskning de seneste 10-15 år
En stor del af sædforskningen har i de sidste to årtier været beskæftiget med udvikling af nye fortyndere til frysning af tyresæd eller fortynding af ornesæd samt optimering af eksisterende teknikker til vurdering af sædkvalitet. En mangel ved de mange forsøg med udviklingen af nye fortyndere har været, at laboratorie vurderingen i reglen kun har omfattet en mikroskopisk vurdering af sædmotilitet, og at eventuelle insemineringsforsøg har været underdimensioneret til at udpege reelle forskelle.
En mindre del af forskningen i den samme periode har omfattet udvikling af nye teknikker bl.a. undersøgelse af DNA-skader på sædceller (Evenson et al. 1994), betydningen af akrosom reaktionen (Whitfield og Parkinson 1992), samt interaktion imellem sædcelle og oocyt. Få teknikker er blevet afprøvet i forbindelse med et tilstrækkeligt stort antal insemineringer, så egentlige fordele ved den nye teknik har kunnet underbygges. En stor udfordring for sædforskningen er, at korrekt dimensionerede insemineringsforsøg er meget arbejdsbelastende at gennemføre og forbundet med store udgifter. De mange faktorer, som har betydning på insemineringsresultatet bl.a. besætning, inseminør, ko/kvie, årstid, bør indrages i forsøget, for at betydningen af de målte sædparametre kan bestemmes præcist.
Jeyendran og Zaneveld (1993) samt Amann og Hammerstedt (1993) beskrev problemerne ved afprøvning af nye laboratoriemetoder til sædundersøgelse og slog fast, at en enkelt test ikke kan forventes at kunne forudsige befrugtningsevnen ved inseminering. Dette skyldes at sædcellen for at kunne befrugte, skal besidde flere egenskaber. De essentielle egenskaber for sædcellen omfatter blandt andet motilitet, ‘normal’ morfologi, evne til at overleve i oviduct miljøet, binding til zona pellucida, evne til at gennemføre akrosom reaktion og endelig fusion med oolemma. Endelig kan skader på sædcellens DNA være afgørende for, om der efter befrugtningen sker en normal udvikling af zygoten. Amann og Hammerstedt (1993) understregede derfor behovet for at udvikle et sæt af test, til undersøgelse af essentielle sædcelle funktioner, og at sammenholde disse tests i et insemineringsforsøg med tilstrækkeligt antal insemineringer. Dimensionering af insemineringsforsØg er tidligere omtalt af Amann (1989), som understregede, at langt den største del af sædforskningen er baseret på utilstrækkelig inseminerings- eller frugtbarhedsdata.
Den mest betydningsfulde metode, som har fundet anvendelse indenfor sædforskningen det seneste årti, er flowcytometri (Morrell 1991). Ved flowcytometri er det muligt at bestemme procentdelen af levende sædceller (viabilitet). Her udover er det muligt at undersøge om sædcellen er kapaciteret (Varner et al. 1993), akrosom reaktionen kan undersøges, og skader på DNA’et kan ligeledes påvises (Evenson et al. 1994). Mulighederne ved flowcytometri er næsten ubegrænsede, idet man ved valg af passende flurochromer (farvestoffer) kan undersøge flere parametre samtidig på den enkelte sædcelle (Graham et al. 1990). Hertil kommer, at et meget stort antal sædceller (10.000 eller flere) kan undersøges hurtigt (under 1 min). Flowcytometrien muliggør desuden kvantificering af DNA indholdet i sædceller. Det er desuden muligt at foretage en kønssortering af sædcellerne ved hjælp af denne metode (Johnson, 1994). En ulempe ved kønssorteringen af sædceller er, at sorteringshastigheden er meget lav (ca. 100 pr. sekund med 90% renhed), og at det således vil tage flere timer at sortere en normal inseminationsdosis til kvæg. Metoden har dog fundet anvendelse til sortering af frisk tyresæd og efterfølgende inseminering dybt intrauterin med meget lav insemineringsdosis (2x105 sperm, Seidel et al. 1997). Forsøget resulterede i, at 82% af de fødte kalve havde det ønskede køn. Meget tyder på, at denne teknik de kommende år vil blive forbedret betydeligt, og at den formentlig vil blive anvendt i stort omfang.
Sædprojektet på KVL
Med udgangspunkt i forprojekt rapportens status over den internationale sædforskning (Johansen og Christensen 1994) blev der ved starten af sædprojektet udvalgt 5 forskningsområder, som forventes at kunne få særlig betydning for dansk kvægavl og svine produktion (tabel 1). Disse 5 områder omfatter: sædkoncentration og viabilitet, oviduktens betydning for sædcellernes overlevelse, akrosom status, in vitro akrosom reaktion, og kromatin struktur. Det blev endvidere konkluderet, at nye teknikker til undersøgelse af sædkvalitet så vidt muligt skal baseres på anvendelse af flowcytometri. I projektets indledende fase blev sædproduktionen og insemineringsarbejdet analyseret for kvæg og svin. Resultatet af dette arbejde samt de to første udvalgte opgaver er i øjeblikket ved at blive gjort op, og vil blive beskrevet løbende i en serie af artikler i DVT.
Tabel 1. Forskningsmæssige områder i sædforskningsprojektet på Sektion for Reproduktion, KVL. De enkelte teknikker vil så vidt muligt blive baseret på brug af flowcytometri
|
Område 1 |
Koncentration og viabilitet |
Udvikling af en metode, som kan anvendes praktisk og er mere nøjagtig end de eksisterende. |
|
Område 2 |
Ovidukt miljø |
Undersøgelse a oviduktens indflydelse på sædcellernes overlevelse. |
|
Område 3 |
Akrosom status |
Etablering af en nøjagtig metode til undersøgelse af akrosom reaktionen. |
|
Område 4 |
In Vitro Akrosim Reaktion |
Undersøgelse af sædcellers evne til at akrosom reagere in vitro |
|
Område 5 |
Sperm kromatin struktur |
Etablering af metoder til undersøgelse af skader på sædcelle DNA. |
Litteratur
Amann RP: Can the Fertility Potential of a Seminal Sample Be Predicted Accurately? J. Androl. 1989, 10: 89-98.
Amann RP, Hammerstedt RH: In Vitro Evaluation of Sperm Quality: An Opinion. J. Androl. 1993, 14: 397-406.
Evenson DP, Sailer BL, Jost JL: Relationship between stallion sperm DNA susceptibility to denaturation in situ and presence of DNA strand breaks. Implications for fertility and embryo viability. Program of Sixth International Symposium on Equine Reproduction; Caxambu; Brazil, 1994. Abstract: 163-164.
Graham JK, Kunze E, Hammerstedt RH: Analysis for sperm cell viability, acrosome integrity, and mitochondrial function using flow cytometry. Biol. Reprod. 1990, 43: 55-64.
Jeyendran RS, Zaneveld LJD: Controversies in the development and validation of new sperm assays. Fertil. Steril. 1993, 59: 726-728.
Johansen D, Christensen P: Sædforskning og husdyravl - teoretiske og praktiske grundlag for fremtidig sædforskning. DSR Tryk 1994.
Johnson LA: Isolation of X- and Y-bearing sperm for sex preselection. In: Oxford Reviews of Reproductive Biology. Editor: H.M. Charlton. 1994; 16: 303-326.
Morrell JM: Applications of flow cytometry to artificial insemination: a review. Vet. Rec 1991, 129: 375-378.
Seidel GE Jr, Allen CH, Johnson LA, Holland MD, Brink Z, Welch GR, Graham JK, Cattell MB: Uterine horn insemination of heifers with very low numbers of nonfrozen and sexed spermatozoa. Theriogenology 1997, 48: 1255-1264.
Varner DD, Bowen JA, Johnson L: Effect of heparin on capacitation/acrosome reaction in equine spermatozoa. Arch Androl 1993, 31: 199-207.
Whitfield CH, Parkinson TJ: Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology 1992, 38: 11-20.
Kilde: Dansk Veterinærtidsskrift nr. 9, 1. maj 1998, 81. årgang side 338-340