Sædforskning og husdyravl. 2. - Bovine ovidukt-specifikke proteiner og deres indflydelse på befrugtningsprocessen

De sidste 10 års forskning har resulteret i udvikling af metoder til in vitro kapacitering af spermier samt in vitro modning af oocyter med efterfølgende in vitro befrugtning og udvikling af embryoner til blastocytstadiet (Avery & Greve, 1995; Avery et al., 1995). Parallelt hermed er der gennem de seneste år udført undersøgelser til belysning af oviduktbiologien hos kvæg. Som del af sædforskningsprojektet ved Sektion for Reproduktion arbejdes der på isolering og karakterisering af oviduktproteiner, og der forskes i disse proteiners betydning for tyre- og ornespermiers modning og befrugtningsevne.

I ovidukten mødes spermatozoer og oocyt(er) og befrugtningen, samt den tidlige embryonale udvikling, finder sted. De sidste ca. 30 år har forskningen vist, at ovidukten er et komplekst organ, som i høj grad er med til at regulere befrugtningsprocessen og den efterfølgende embryonudvikling.

Processen, gående fra spermiens henholdsvis oocytens dannelse til den endelige befrugtningsproces, er vidtgående beskrevet af blandt andre Yanagimachi (1994). Kort fortalt sker der følgende i ovidukten: Ved ankomst efter inseminering til oviduktens nedre del, isthmus, overgår spermiet i en fysiologisk dvaletilstand (anabiose). Spermierne frigøres gradvist fra epithelvævet, sandsynligvis som led i kapacitationsprocessen og med kontakten med epithelcellerne som nødvendig faktor (Smith, 1997; Suarez, 1997). Efter frigørelsen hyperaktiveres de, og bevæger sig videre op igennem ovidukten. I overgangen mellem oviduktens isthmus- og ampulla-regioner møder spermierne oocyten, hvorpå akrosomreaktion og befrugtningsproces finder sted (kapacitationsproces, hyperaktivering og akrosomstruktur er beskrevet i inserat). I løbet af passagen gennem ovidukten er deres antal blevet yderligere reduceret, idet der foregår en selektion af levende, motile spermier.

Udskillelse af proteiner i den bovine ovidukt

Oviduktens epithelceller secernerer en række proteiner til oviduktvæsken, og nogle af disse proteiner er specifikke for oviduktmiljøet (de findes ikke i det perifere blodsystem). Blandt de oviduktspecifikke proteiner er der beskrevet seks, som ydermere har den egenskab, at de binder sig til sædcellens membran (Gerena & Killian, 1990; Joshi 1988; LaPointe & Sirard, 1996; McNutt et al., 1992). Proteinerne er, på nær et enkelt (estrus-associated protein), utilstrækkeligt undersøgt med hensyn til struktur, bindingssted på sædcellemembranen og biologisk funktion.

Estrus-associated protein

Det bedst undersøgte oviduktprotein, estrous associated protein (EAP; bovint oviduktin, bovint ovidukt-specifikt glycoprotein) er et glycoprotein (1), der binder sig til spermiets hoved og midterstykke, men mest til mellemstykket, hvor mitochondrierne er placeret.

EAP’s molekylvægt er 85-95 kDa (2), heraf udgør proteindelen 57 kDa, mens resten, 30-40%, er kulhydrat (figur 1). Ved oprensning af EAP iagttages molekylet som en blanding af mindst to proteiner med identisk aminosyresekvens, men med forskellige længder og typer af kulhydratkæder (Boice et al., 1990; Gerena & Killian, 1990; Nancarrow & Hill, 1995). At der er påvist forskellige molekylære former af EAP efter oprensning, tyder på, at EAP in vivo eksisterer i forskellige isoformer (3). I dagene omkring tidspunktet for ovulation (1 dag før og 2-4 dage efter, svarende til et interval på ca. 4 dage efter forekomst af den præovulatoriske LH-bølge (4)) udskilles EAP i høje koncentrationer, 0,5-5 mg/ml med et gennemsnit på 1 mg/ml (figur 2), og EAP udgør 7-10% af oviduktvæskens totale proteinmængde. Proteinet udskilles i lave koncentrationer under lutealfasen (figur 2). Man mener, at dets produktion og udskillelse er delvist afhængigt af koncentrationen af østradiol i det perifere blodsystem, hvorfor udskillelsen er tæt korreleret til brunstperioden. De nyeste forskningsresultater fra Sun et al. (1997) åbner muligheder for en bedre forståelse af oviduktens processer. Artiklen beskriver identifikation og delvis karakterisering af en receptor for LH på oviduktepithelcellerne. Effekten af LH’s binding til receptoren er en forlængelse af det til EAP-genet svarende mRNA’s (5) halveringstid, således at translationtiden(6) forlænges. Sammenlagt inducerer østradiol transkription (5) af EAP-genet i oviduktepithelet, mens forhøjede LH- koncentrationer bevirker en længerevarende translation (5) af mRNA. Dette kommer in vivo til udtryk som en øget syntese og sekretion af EAP i den periovulatoriske periode, når den præovulatoriske LH-bølge indfinder sig. En anden hypotese går ud på, at syntese og udskillelse af EAP direkte eller indirekte hæmmes af progesteron i det perifere blodsystem. EAP-koncentrationen stiger derfor efter luteal regression, mens den undertrykkes i lutealfasen (figur 2). Denne hypotese er imidlertid kun beskrevet fyldestgørende for guldhamstre (Komiya et al., 1996), og gælder måske ikke generelt.

Flere artikler har redegjort for, at EAP under in vitro-betingelser er i stand til at forlænge spermiers motilitet og deres levedygtighed (Abe et al., 1995; Satoh et al., 1995). Det er endvidere vist, at EAP in vitro er i stand til at kapacitere tyrespermier (King et al., 1994; Abe et al.,1995). EAP kapaciterer tyrespermier lige så effektivt som andre kendte kapacitationsinduktorer (bovint serumalbumin, heparin etc.), men på meget kortere tid, 20-30 minutter i stedet for albumins og heparins 4-12 timer. Det er ikke afklaret, om EAP påvirker spermiet via binding til specifikke receptorer, men King & Killian (1994) har beskrevet, at EAP binder sig fast til spermiemembranen. Dette kan tyde på binding til en receptor, men teorien er vanskeligt forenelig med den snævre tidsramme på 20-30 minutter for EAP-formidlet kapacitation. Normalt tager receptorbinding og efterfølgende reaktioner længere tid. EAP har tillige en positiv indflydelse på befrugtningsprocessen, idet befrugtningsraten ved in vitro fertilisering (IVF) øges ved tilsætning af EAP (King et al., 1994; Martus et al., 1997).

Figur 1. Skematisk gengivelse af den molekylære struktur af oviduktinet EAP.Peptidkæde (blå), kulhydrat (rød). Til peptidkæden, der er kernen i EAP-proteinet, er bundet kæder af kulhydrater. Peptidkæden er ved fysiologisk pH svagt positivt ladet, mens tilstædeværelsen af sialinsyre på kulhydratkæderne gør disse negativt ladede. EAP har ved fysiologisk pH en negativ ladning på grund af et lavt isoelektrisk punkt. På grund af ladningsfordelingen på proteinet er antal og art af kulhydratkæder bestemmende for proteinets rumlige struktur. Oviduktiner genkender og binder sig til en speciel kulhydrat-sekvens, men de spalter den ikke (Malette et al., 1995). Denne kulhydratsekvens er hyppigt forekommende på Zona pellucida, hvorfor oviduktiner binder sig hertil; i nogle tilfælde uspecifik på tværs af dyrearterne. Når oviduktinet har bundet sig til Zona pellucida, vender dets kulhydratkæder ud mod væsken, og disse er derfor rettet mod spermierne

Figur 2. Estrus-associated protein (EAP) og plasmaprogesteron (P4) gennem koens østralcyklus.EAP i oviduktvæsken (blå linie) og plasma P4 (rødstiplet linie) er fulgt i prøver taget med 1-3 dages intervaller gennem en periode på 46 dage for en ko, der blev brunstsynkroniseret med prostaglandin på dag -3. X-akse: Dag, hvor dag-0 er tidspunktet for den første ovulation efter prostaglandininduktionen af luteal regression (pil). Y-akse: EAP-koncetrationen (mg/ml) i oviduktvæske, og P4 (mg/ml) i plasmaprøver. Det ses, at P4-koncentrationen efter luteal regression, dagene 18-22, og omkring dag 45 er lave. P4-koncentrationen er højest i lutealfasen, dagene 5-18, dagene 23-38. Sammenfaldende hermed fluktuerer EAP-koncentrationerne, højest på dagene 21-26 og 43-46, og lavest i midtcyklus dagene 15-21 henholdsvis 28-42. Der er en klar tendens til, at EAP-koncentrationen er omvendt proportional med plasma P4-koncentrationen

Oviduktiner

EAP hører til stofgruppen oviduktiner, der er en gruppe af ovidukt-specifikke glycoproteiner (1) (figur 1) med sammenlignelige egenskaber. Oviduktiner findes hos adskillige dyrearter og har følgende karakteristika (Malette et al., 1995):

1. Proteinkæderne udviser mange fællestræk (høj homologi(7)).
2. Proteinet er påhæftet kulhydrater, og disse udgør fra 30% til 70% af proteinets samlede molekylvægt. Hos flere dyrearter optræder proteinet som en blanding af isoformer.
3. Oviduktiner hos undersøgte arter inducerer kapacitationsprocessen.
4. Oviduktiner binder sig til oocyter.
5. For nogle arters vedkommende, blandt andet kvæg, er det vist, at oviduktin øger fertilisations-raten ved IVF.

Det er rapporteret (O’Day-Bowman et al.,1996), at oviduktin fra mennesker henholdsvis bavianer bandt sig lige godt til oocyters Zona pellucidae fra begge dyrearter. Bindingen af oviduktinernes peptidkæde til oocytens kulhydratkæder er med andre ord ikke generelt artsspecifik. I modsætning hertil formidler oviduktinernes kulhydratkæder artsspecifik binding af spermier til oocyter. Således bærer kulhydratkæderne information om spermiernes artsspecifikke genkendelse af oocyter (jævnfør figur 1). Disse resultater er i overensstemmelse med de nyeste observationer inden for glycoproteinforskning (Verhage et al., 1997). Idag mener man, at kulhydratkæderne, i langt højere grad end tidligere antaget, aktivt tager del i specifik binding til receptorer. Hele befrugtningsprocessen reguleres ifølge Tulsiani et al. (1997) af glycoproteiner.

Andre ovidukt-specifikke proteiner

Der er blevet beskrevet tre oviduktspecifikke proteiner (molekylvægte 35-40 kDa), som kræver tilstedeværelse af calcium-ioner, for at binding til spermiemembranen kan finde sted (LaPointe & Sirard, 1996). Proteinerne binder sig således in vitro til sædcellemembranen, i et miljø der er identisk med de betingelser, som skal være til stede for induktion af hyperaktivitet og akrosomreaktion hos spermier in vivo. I ovidukten er koncentrationen af fri calcium-ioner i den periovulatoriske periode signifikant 0.2-0.5 mmol/l højere end i lutealfasen.

Endvidere er to andre oviduktspecifikke proteiner med affinitet over for spermiemembranen blevet påvist (Gerena & Killian, 1990; Joshi, 1998). Disse proteiner har en molekylvægt på omkring 50 kDa henholdsvis 20-25 kDa. Om det fØrstnævnte er det rapporteret, at det er til stede gennem hele cyklusperioden. Proteinernes funktioner er endnu ukendte.

Interaktion mellem oviduktproteiner og spermier hos kvæg

Spermierne transporteres efter insemination af peristaltiske uteruskontraktioner gennem uterus til oviduktens isthmus-del. Her bindes de som tidligere nævnt til epithelet. Kontakten kan opstå ved, at spermierne indfanges af de ciliebærende epithelceller (Suarez, 1997). Det er dokumenteret, at der ved inkubation af spermier med oviduktepithelvæv in vitro udskilles proteiner til mediet (McNutt et al., 1992). Disse proteiner findes ikke i seminalvæsken, ejheller kan de påvises i oviduktepithelvævskultur uden sædceller. Der er derfor ingen tvivl om, at spermierne påvirker epithelcellerne. Oviduktvæske opsamlet ved hjælp af kateter efter insemination indeholder meget få levende spermier. Dette stemmer overens med observationen af, at spermierne binder sig til epithelvævet (Suarez, 1997), og at de fleste spermier, som findes i oviduktvæsken er kapaciteret (Smith, 1997).

Næste trin i spermiernes transport mod oocyten er den gradvise frigørelse fra oviduktepithelvævet i den nedre del af isthmus. En mulig forklaring på dette fænomen er, at spermierne sandsynligvis kapaciteres af det af epithelvævet udskilte EAP. Kapacitationen ændrer spermiernes membran, så de frigøres og svømmer videre mod oviduktens ampul-del. Frigørelsen af spermierne er således påvirket af koens reproduktionscykliske reguleringsmekanismer, fx stigningen i blodets østrogenkoncentration 1-2 dage før ovulation og den præovulatoriske LH-bølge omkring 24 timer før ovulation, idet disse hormoners øgede koncentration i det perifere blodsystem inducerer en øget syntese af EAP i ovidukten. Når spermierne svømmer videre, bevirker den destabiliserede membran, at den intracellulære koncentration af calcium-ioner øges. Dette fører til hyperaktivering, og når de calciumafhængige 35-40 kDa oviduktproteiner binder sig til deres receptorer, igangsættes akrosomreaktionen. Parallelt hermed har EAP fra ampulla bundet sig til oocytens Zona pellucida, således at molekylet kan formidle kontakten mellem spermie og oocyt. Denne forklaring på interaktionen mellem ovidukt og spermier antyder, at EAP har mere end én funktion, afhængigt af hvilken region af ovidukten proteinet udskilles fra. De forskellige funktioner varetages muligvis af isoformer af EAP, da mængden og typen af kulhydratkæder kan definere genkendelse af forskellige receptorer; dette er dog endnu ikke afklaret.

In vivo studier

De ovenfor beskrevne observationer af oviduktproteiner og deres betydning for spermier er væsentligst baseret på in vitro undersøgelser. Der er indtil nu ikke udført forsøg, der viser, hvordan samspillet mellem spermier og oviduktmiljøet forløber in vivo. En eksperimentel model til undersøgelse af befrugtningsprocessen in vivo er udviklet på Dairy Breeding Research Center (Pennsylvania State University, USA): Oviduktvæske opsamles fra æggelederens isthmus- og ampullaregioner via katetre før, under og efter insemination. Således opnås materiale til beskrivelse af væskens sammensætning, samtidig med at der opnås mulighed for undersøgelse af de spermier, som er frigjort fra epithelet. Resultaterne af sådanne eksperimenter vil kunne bidrage til en øget forståelse af oviduktens og spermiernes funktioner.

Processer som spermierne må undergå, for at kunne gennemføre befrugtningsprocessen:

Kapacitation er en nødvendig forudsætning for en normal akrosomreaktion. De molekylære og cellulære mekanismer, der initierer kapacitationen, er endnu ikke helt afklaret. Man ved, at den normale spermiemembran før kapacitation er dækket af et beskyttende lag cholesterol, og at membranstrukturen er helt intakt. Ved kapacitation destabiliseres membranen, blandt andet fjernes eller omstruktures laget af cholesterol, hvorved membranen bliver mere ’flydende’. Herved åbnes membranen for andre bestanddele af oviduktvæsken, fx calcium-, natrium - og hydrogencarbonat-ioner. In vitro induceres kapacitationen ved tilsætning af forskellige reagenser til mediet, fx albumin og heparin.

Kapacitationen resulterer i en hyperaktivering af spermierne: Deres bevægelsesmønster ændrer sig, og haleudsvingene bliver kraftigere i ét plan, så at spermierne ikke roterer. Dette har betydning for penetrationen af Zona pellucida. Spermiernes energiomsætning forøges, og hyperaktivering er derfor kritisk for spermierne. Hyperaktivering er afhængig af koncentrationen af calcium-, hydrogencarbonat- og kalium-ioner, og den induceres formentlig ved direkte receptor-medieret overførsel af signaler fra oviduktens epithelceller til spermien, via processer der er afhængige af mitochondriernes energiomsætning. Dette er i overensstemmelse med, at EAP binder sig til spermiets hoved og mellemstykke.

Akrosomreaktionen er den ultimative klargøring af sædcellen til befrugtning af ægget (Florman et al., 1997): I modsætning til kapacitationen er processen irreversibel. Den foregår in vivo ved kontakt med ægget, og den forløber ved udskillelse af enzymer deponeret i akrosomet. Disse enzymer nedbryder oocytens Zona pellucida, som består af glycoproteiner, og spermiet fusionerer med oocytmembranen. Akrosomreaktionen kræver høje intracellulære koncentrationer af calcium-ioner, der frembringes som effekt af kapacitationen.

Ordliste

Nedenstående bringes definitioner og forklaringer på biokemiske fagudtryk, der forekommer i teksten. I teksten er de fagudtryk, som forklares hér, angivet med højtskrevet nummer, svarende til nummereringen her i listen.

Abe H, Sendai Y, Satoh T, Hoshi H: Secretory products of bovine epithelial cells support the viability and motility of bovine spermatozoa in culture in vitro. J Exp Zool 272, 54-61, 1995.

Avery B, Brandenhoff HR, Greve T: Development of in vitro matured and fertilized bovine embryos, cultured from days 1-5 post insemination in either Menezo-B2 medium or in HECM-6 medium. Theriogenology 44, 935-945, 1995.

Avery B, Greve T: Impact of PercollR on bovine spermatozoa used for in vitro insemination. Theriogenology 44, 871-878, 1995.

Florman HM, Lemos JR, Arnoult C, Kazam I, O’Toole C: Sperm ion channel regulation during capacitation and fertilization. Biol Reprod 56 Suppl 1, 34, 1997.

Gerena RL, Killian GJ, 1990: Electrophoretic characterization of proteins in oviduct fluid of cows during the estrous cycle. J Exp Zool 256, 113-120, 1990.

Joshi MS: Isolation, cell culture and immunocytochemical characterization of oviduct epithelial cells of the cow. J Reprod Fertil 83, 249-261, 1988.

King RS, Anderson SH, Killian GJ: Effect of bovine oviductal estrus-associated protein on the ability of sperm to capacitate and fertilize oocytes. J Androl 15, 468-478, 1994.

Komiya H, Onuma T, Hiroi M, Araki Y: In situ localization of messenger ribonucleic acid for an oviduct-specific glycoprotein during various hormonal conditions in the Golden hamster. Biol Reprod 55, 107-1118, 1996.

LaPointe S, Sirard M-A: Importance of calcium for the binding of oviductal fluid proteins to the membranes of bovine spermatozoa. Mol Reprod Dev 44, 234-240, 1996.

Malette B, Paquette Y, Merlen Y, Bleau G: Oviductins possess chitinase- and mucin-like domains: A lead in the search for the biological function of these oviduct-specific ZP- associating glycoproteins. Mol Reprod Dev 41, 384-397, 1995.

Martus NS, Verhage HG, Mavrogianis PA, Thibodeaux JK: Enhanced in vitro development of bovine embryos in the presence of a bovine oviductal specific glycoprotein. Theriogenology 47, 334, 1997.

McNutt T, Rogowski L, Vasilatos-Younken R, Killian G: Adsorption of oviductal fluid proteins by the bovine sperm membrane during in vitro capacitation. Mol Reprod Dev 33, 313- 323, 1993.

Nancarrow CD, Hill JL: Oviduct proteins in fertilization and early embryo development. J Reprod Fertil Suppl 49, 3-13, 1995.

O’Day MB, Mavrigianis PA, Reuter LM, Johnson DE, Fazlebas AT, Verhage HG: Association of oviduct-specific glycoproteins with human and baboon (Papio anubis) ovarian oocytes and enhancement of human sperm binding to human hemizonae following in vitro incubation. Biol Reprod 54, 60-69, 1996.

Satoh T, Abe H, Sendai Y, Iwata H, Hoshi H: Biochemical characterization of a bovine oviduct-specific sialo.glycoprotein that sustains sperm viability in vitro. Biochim Biophys Acta 1266, 117-123, 1995.

Smith TT: Modulation of sperm function by oviductal epithelium. Biol Reprod 56, Suppl 1, 24-25, 1997.

Suarez SS: The oviductal sperm reservoir in mammals: Mechanisms of formation. Biol Reprod 56 Suppl 1, 25, 1997.

Sun T, Lei ZM, Rao CV: A novel regulation of the oviductal glycoprotein gene expression by luteinizing hormone in bovine tubal epithelial cells. Mol Cell Endocrin 131, 97-108, 1997.

Tulsiani DRP, Yoshida-Komiya H, Araki Y: Mammalian fertilization: A carbohydrate-mediated event. Biol Reprod 57, 487-494, 1997.

Verhage HG, Mavrogianis PA, O’Day-Bowman MB, Schmidt A, Arias EB, Donnely KM, Thibodeaux JK, Fazleabas AT, Jaffe RC: Characteristics of an oviductal glycoprotein and its potential role in the fertilization process. Biol Reprod 56 Suppl 1, 24, 1997.

Yanagimachi R: Mammalian fertilization. In: The Physiology of Reproduction, 2nd edition (eds. Knobil E, Neill JD), New York, Raven Press, Ltd., 1994, pp 189-317.

Kilde: Dansk Veterinærtidsskrift nr. 13, 1. juli 1998, 81. årgang side 482-485