Metoder til måling af ketose hos søer

I den moderne svineproduktion skal søerne producere mere mælk til et stigende antal pattegrise, og der stilles derfor større krav til søernes energiomsætning. Diegivende søer kommer i negativ energibalance i diegivningsperioden, da de forbruger mere energi end de optager. Derfor mobiliseres fedt fra kroppen, der dels bruges til mælkefedt og dels til forbrænding. Når søerne er i negativ energibalance, er de samtidig sårbare overfor at udvikle ketose. Ketose er et resultat af et underskud af glukogene næringsstoffer (glukose og næringsstoffer der kan omdannes til glukose) og større omdannelse af fedt til ketonstoffer end det perifere væv kan omsætte. Det optræder oftest ved et markant skifte fra forbrænding af kulhydrater til forbrænding af fedt i leveren. Det kan ske ved fodring med lav kulhydrat/høj fedt, der ikke opfylder dyrets behov (fx når kulhydrater prioriteres til laktosesyntese i laktationen), ved anvendelse af ketogene foderstoffer (eksempelvis fedtkilder med mellemkædede fedtsyrer), ved sukkersyge (hvor kroppen ikke kan optage kulhydrater fra blodet) eller ved sult [1]. Kroppen er afhængig af energi fra kulhydrater – eksempelvis kan et organ som hjernen ikke forbrænde fedtsyrer, men kan forbrænde ketonstoffer. Tvinges kroppen til at dække for stor en del af energien fra fedtforbrænding, så der bliver mobiliseret en stor mængde fedtsyrer fra fedtvæv, vil leveren optage frie fedtsyrer fra blodet. I leveren kan de frie fedtsyrer blive oxideret, omsat til ketonstoffer acetoacetat, β-hydroxybuturat og acetone eller deponeres som triacylglycerol [8]. Ophobning af store mængder fedt som triacylglycerol i leveren kan føre til dannelse af såkaldt fedtlever.

På kort sigt vil omdannelsen af fedtsyrer til ketonstoffer være gavnlig, idet ketonstofferne er en let omsættelig energikilde i det perifere væv. Hvis dannelsen af ketonstoffer overstiger forbruget i det perifere væv, vil der først ske en ophobning af ketonstoffer i blodet. Overstiger koncentrationen i blodet en vis tærskelværdi udskilles ketonstofferne i urinen og dyret pådrages herved også en belastning af syre/base balancen [15]. Ved høje koncentrationer af ketonstoffer i blodet vil koncentrationen af acetone i udåndningsluften være så høj, at man kan lugte acetone. Ketonæmi (ketonstoffer i blodet) medfører svimmelhed og appetitløshed, som igen øger fedtmobiliseringen. Når ketosen er grundlagt, er der således tale om en ”ond cirkel”. For at stoppe processen skal kroppen enten tilføres glukogene næringsstoffer, terapi der øger glukogen status gennem nedsat glukoseomsætning i det perifere væv eller i tilfælde af (human) sukkersyge, insulinterapi [1].

Hos kvæg er ketose under nogle produktionsforhold en hyppig stofskiftelidelse i tidlig laktation, og resulterer blandt andet i en nedgang i mælkeydelsen hos køerne [1].

Ketose har ikke tidligere været påvist hos søer, men i en mindre undersøgelse har man fundet, at nogle søer udskiller ketonstoffer (betahydroxybutyrat, BHB) i mælken. Det er et kendt fænomen i de danske farestalde, at nogle søer går fra foderet, taber sig og producerer mindre mælk, uden at der er tegn på infektion. På grund af den reducerede mælkeproduktion oplyser svineproducenter om utrivelige pattegrise, der hæver dødeligheden blandt pattegrisene og øger behovet for ammesøer. Tilstande, der medfører store økonomiske tab for svineproducenten.

Disse symptomer kan forenes med kliniske symptomer på ketose, hvorfor mulig forekomst af denne lidelse blandt søerne bør klarlægges.

Formålet med undersøgelsen var at sammenligne målemetoder og finde en metode, som i praksis nemt og hurtigt kan bruges til at afklare, om en so udskiller ketonstoffer.

Ketolac

Ketolac måler forekomsten af BHB i mælk kvantitativt. Der tilsættes mælk til måleområdet, så dette er helt dækket af mælk. Sticken holdes stille i tre sekunder, hvorefter mælken rystes af. En eventuel farveændring på sticken aflæses efter præcis 60 sekunder [11]. Måleområdet på Ketolac-sticken indeholder et enzym, β-hydroxy-dehydrogenase, som ved tilstedeværelse af BHB, producerer co-enzymet, NADH. Ligeledes indeholder stickens måleområde nitroblå tetrazolium, som af NADH omdannes til en lilla farve – se figur 1. Jo mørkere lilla, jo højere koncentration af BHB i mælken. Farveskalaen, på røret, angiver koncentrationer af BHB på 0, 50, 100, 200, 500 og 1000 µmol/L mælk [11]. For let at kunne sammenligne resultaterne i nærværende meddelelse, refereres koncentrationsmålingerne for Ketolac fremover i mmol/L (mM). Ketolacrørene skal opbevares på køl. Omkring 15 minutter før brug tages de ud af køleskabet, så sticksene har stuetemperatur ved brug [11].

 
Figur 1. Rør og stick til måling af ketonstoffet, BHB, i mælk. Ved at sammenligne den farve sticken får,
efter endt måling,  med farvekoderne på røret, kan man se, hvilken BHB-koncentration mælken indeholder

PRECISION XCEED

Figur 2. MediSence Precision
Xceed fra Abott Lboratories A/S.
Et lille apparat, der blandt andet
er designet til at kunne måle
koncentrationen af ketonstoffer
i humant blod [4]

MediSence Precision Xceed (Abott Laboratories A/S) er et lille apparat, der vejer 79 gram og måler 9,9 x 5,6 x 2,2 cm. Det er blandt andet designet til at måle forekomsten af ketonstoffer i humant blod, og måler koncentrationen af BHB kvantitativt i området 0,0–8,0 mM. Overstiger koncentrationen 8,0 mM, vises blot bogstaverne ”HI” (high) i displayet [4].

Der tilsættes en dråbe blod til teststrippens måleområde (”sample chamber”, jf. figur 3).

Når ketonstofferne (BHB) fra blodet får kontakt til teststrip’en, sker der en kemisk reaktion, hvorved der frigives nogle elektroner, som transporteres til elektroden inde i apparatet. Hermed genereres en svag strøm, som er proportional med koncentrationen af BHB i blodet [2]. Selve analysen varer cirka 10 sekunder.

Figur 3. Teststrip’en, som sættes ind i MediSence
Precision Xceed, og derefter tilføres en dråbe blod
til måleområdet – her kaldet sample chamber [2]

Teststrip’en (figur 3) indeholder forskellige elektroder.

Den elektriske strøm mellem ”trigger elektroden” og referenceelektroden skal detekteres af apparatet, før målingen kan begynde. Det tilførte blod skal altså flyde forbi referencen og de målende elektroder for at opnå kontakt til ”triggeren”, før en måling kan finde sted.

”Triggeren” er designet til at skulle minimere risikoen for de fejl, der skyldes utilstrækkelig mængde tilført blod. Når der tilsættes tilstrækkeligt med blod (1,5 μL, hvilket svarer til en stor bloddråbe), påbegyndes målingen automatisk [2].

Precision Xceed måler BHB-koncentrationen i plasma [2]. Et tidligere humant valideringsstudie, udført af forhandleren, har testet Precision Xceed op mod hæmatokritniveauer på 30, 35, 40, 45, 55 og 60 pct. Studiet viste, at resultatet i gennemsnit afveg med 0,06 mM fra standardmålingen. Studiet konkluderede, at testen giver et klinisk brugbart resultat indenfor en hæmatokritramme på 30-60 pct. [2] – indenfor hvilken søers hæmatokritniveau også ligger [14]. Samme studie foretog en vurdering af, hvorvidt rystelser under analysen betød noget for resultatet. Afvigelsen her var på 0,01 mM, og betydningen af rystelser var dermed ikke statistisk signifikant [2].

Precision Xceed, der er et apparat udviklet til sukkersygepatienter, er i denne undersøgelse valideret med henblik på måling af ketonstoffer i blodet hos søer. Apparatet er let anvendeligt i praksis, og vil derfor være et velegnet redskab til overvågning af ketose i sobesætningerne.

RANDOX RANBUT

Måling af BHB i serum eller plasma anses for at være den gyldne standardmetode for diagnosticering af subklinisk ketose [7]. Randox Ranbut er en enzymatisk metode, som måler niveauet af D-3-hydroxybutyrat i serum eller plasma. Metoden baseres på oxidation af D-3-hydroxybutyrat (BHB) til acetoacetate ved hjælp af enzymet 3-Hydroxybutyrate dehydrogenase. Oxidation af BHB er koblet til reduktion af NAD+ til NADH (se figur 4), og omfanget af denne reaktion kan direkte sammenholdes med koncentrationen af BHB [6]. Ifølge producenten har Ranbut en høj linearitet, er yderst sensitiv (til 0,1 mmol/l) og stabil [6]. Denne metode benyttes rutinemæssigt til diagnosticering af subklinisk ketose på blandt andet Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet og vil derfor fungere som kontrolmåling for Precision Xceed i denne undersøgelse.

 
Figur 4. Princippet bag den enzymatiske målemetode, Randox Ranbut [5]

Ketolac

Ketolac blev brugt i en mindre undersøgelse til at belyse, om det i praksis var muligt at måle forekomsten af BHB i somælk. Studiet vedrørende Ketolac er således ikke et valideringsstudie.

I undersøgelsen indgik 47 søer. Testperioden strakte sig fra søerne farede og frem til fravænning (cirka fem  uger). Hver enkelt so fik tildelt et ”ketose-kort”. På dette kort noteredes soens huld ved indsættelse og ved fravænning. Huldet vurderedes på en skala på 1-4, hvor 4 var fed og 1 var mager, se appendiks 1. Ligeledes noteredes, hvor mange kuld soen havde fået i alt, den aktuelle, fødte kuldsstørrelse, hvor mange grise den skulle passe, samt hvorvidt soen havde ædt op eller ej. Til sidst noteredes mængde tildelt foder, samt hvilke behandlinger soen gennemgik i farestalden.

Det antages, at søer har subklinisk ketose i op til tre dage før der ses kliniske symptomer. Derfor blev samtlige søer testet for udskillelse af BHB i mælken to gange ugentligt.

Figur 5. Udmalkning af so

I hele undersøgelsesperioden var der fokus på ikke at berøre stickens måleområde, samt at beskytte dette imod fugt og lys, da det kunne medføre usikkerhed omkring måleresultatet [11]. Der blev malket så meget mælk som muligt, så måleområdet var helt dækket af mælk. Dette lod sig nemmest gøre på de bagerste patter og lige før en diegivning. Nærværende testmetode var derfor utrolig tidskrævende, idet samtlige søer i farestalden skulle overvåges nøje, for dermed at sikre malkning på det rigtige tidspunkt. Gyltene havde generelt en tendens til at lade pattegrisene ”sove” med en patte i munden, hvorfor disse dyr var særlig svære at malke. Kontakt mellem stick og patte formodes at kunne udgøre en måleusikkerhed. ´

Det blev derfor noteret på ”ketose-kortet”, når en so var så svær at malke, at berøring var nødvendig for at sikre tilstrækkeligt med mælk i måleområdet.

Efter malkning blev sticken holdt stille i tre sekunder, hvorefter mælken blev rystet af. Jo længere tid måleområdet kunne reagere med mælken, jo mørkere blev farveændringen. Derfor blev en eventuel farveændring på sticken aflæst efter præcis 60 sekunder, som anbefalet [11]. Der blev ikke brugt oxytocin til at fremme mælkenedlægningen.

Precision Xceed

Dette er et håndholdt apparat, som oprindeligt er udviklet til diabetespatienter. Det er let anvendeligt i praksis, og kunne derfor være et velegnet redskab til overvågning af ketose i sobesætningerne. Apparatet måler koncentrationen i en enkelt bloddråbe.

Valideringen tog udgangspunkt i at undersøge, om målinger udført med MediSence Precision Xceed havde samme kvalitet som målinger udført med Randox Ranbut, der rutinemæssigt bruges til måling af ketose hos søer i forskningsprojekter.

Der blev indopereret venekatetre i Vena Cava på fire grise på Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet, for dermed at undgå at stresse dyrene under blodudtagningen. Grisene var almindelige slagtesvin på omkring 60 kg, og blev vurderet egnede (raske) på baggrund af foderoptag og tilvækst. Ligeledes vurderedes hårlag, bevægelighed, forekomst af rifter/sår samt grisenes interesse for omgivelserne. Grisene blev under hele perioden fodret to gange dagligt med et lavproteinholdigt foder.

10 dage efter at venekatetrene blev indopereret, blev der udtaget 10 ml, heparinstabiliseret fuldblod fra hver gris. På den måde blev det sikret, at grisene hverken led af postoperativt stress, eller påført stress forårsaget af fiksering eller venepunktur. Begge dele kunne formodes at have indvirkning på blodets sammensætning. Blodet blev udtaget to timer efter fodring for på denne måde at sikre, at grisene ikke udskilte ketonstoffer på grund af sult.

Blodet blev herefter tilsat D-(R)-3-hydroxybutyrat i seks niveauer: blank (0 mM), + 0,1 mM, +0,25 mM, +0,75 mM, +2,5 mM og +5 mM. Fuldblodet blev straks efter analyseret med Precision Xceed. Efter analysen med Precision Xceed, blev fuldblodet centrifugeret, plasma høstet og efterfølgende analyseret for BHB ved Randox Ranbut 1007 / RB 1008.

Under valideringsstudiet, blev der foretaget trippelbestemmelse af hver måling med Precision Xceed.

Ketolac

Ketolac er en kvantitativ test og 0,2 mM i mælken blev sat som skæringsgrænse for, hvornår en so var ketosepositiv. Denne tærskelværdi blev sat på baggrund af et studie udført af Jean and Chiang, 1999 [9]. Her iagttog man niveauer for BHB hos søer ved forskellige fedtkilder i foderet. Det højest observerede normalniveau i dette studie svarede til 0,25 mM. Dette niveau blev observeret ved fodring med mellem-kædede fedtsyrer. Ved fedtkilder som kokosolie og sojaolie lå niveauet mellem 0,05-0,15 mM eller lavere [9]. Disse niveauer er dog plasmaniveauer – og fra kvæg ved man, at koncentrationen i plasma er højere end i mælk[10].

Der indgik 47 søer i pilotstudiet. De blev testet to gange ugentligt i fem uger i farestalden, så der blev i alt foretaget 422 målinger for BHB. Med en tærskelværdi på 0,2 mM havde 14,5 pct. af de 422 målinger en værdi svarende til 0,2 mM eller højere. Da hver so blev testet 8-10 gange i løbet af diegivningsperioden, svarer det til, at 7 pct. af søerne mindst én gang havde en værdi på 0,2 mM eller højere.

En årsag til ketose kan være, at soen ikke indtager nok foder til at dække energibehovet. Derved udvikles en negativ energibalance, som kan medføre en ketotisk tilstand [1]. Dog kan selve ketosen også resultere i, at en so går fra foderet. Derfor er det relevant at se på, hvor mange søer, der ved første positive måling havde spist op, og ved efterfølgende positive måling var gået fra foderet. Denne observation giver et overblik over, hvor mange søer der formentligt gik fra foderet på grund af ketose (primær ketose) og altså ikke gik fra foderet som følge af anden sygdom (sekundær ketose). 4,3 pct. af søerne havde ædt op ved første positive måling men ikke ved den efterfølgende, positive måling.

Der var ikke signifikant sammenhæng mellem forekomsten af BHB-koncentrationer over ≥ 0,2 mM og registreringer som født kuldstørrelse, antal diende grise ved siden, kuldnummer, huld og testtidspunkt i diegivningsperioden.

For at få et indblik i, hvorvidt Ketolac var i stand til at reproducere sine resultater, blev der udført 30 dobbeltmålinger. Målingerne blev udført på mælk fra samme patte med maksimalt to minutter imellem hver måling. Som følge af den begrænsede mængde mælk ved hver malkning, var det ikke muligt at foretage to målinger på én malkning. Resultaterne af disse dobbeltmålinger fremgår af figur 6. Dobbeltmålingerne blev kun godkendt, hvis malkningen til begge målinger forløb ens – let eller svær.

 
Figur 6. Billederne viser nogle af de dobbelttest, der blev udført med Ketolac.
Af billedet længst til venstre fremgår det, at der mellem enkelte tests var en acceptabel overensstemmelse, mens billedet længst til højre bevidner, at der ved nogle tests slet ikke var overensstemmelse

Da resultatet på Ketolac aflæses på en farveskala, kan to næsten ens farvereaktioner nemt aflæses med +/- 0,05 mM. Ses der bort fra afvigelser af denne størrelsesorden, var der overensstemmelse i 60 pct. af tilfældene mellem de tilfældigt foretaget dobbeltmålinger, jf. figur 7. Det understreges dog, at denne undersøgelse vedrørende Ketolac ikke kan betragtes som et valideringsstudie.

 
Figur 7. Figuren viser resultatet af de udførte kontrolmålinger. Ved de prøver, hvor der ikke er vist en søjle (1. test, 2. test eller begge tests), blev koncentrationen i mælken målt til 0 mM

Ved yverbetændelse kan der til tider ses en øget koncentration af BHB i mælken, hvilket kan skyldes bakteriel produktion af BHB, en nedsat mælkeproduktion eller en skadet blod-mælk-barriere [12]. Da der i dette studie ikke kunne malkes mælk nok ud til at undersøge for celletal, kan det ikke udelukkes, at en subklinisk yverbetændelse kan have påvirket resultatet. Visuelt tydeligt inficerede patter blev ikke malket. Søerne var generelt svære at malke, og der var da også signifikant (p = 0,0045) flere positive søer (≥0,2 mM) blandt de søer, som var svære at malke, sammenlignet med dem, hvor mælken dryppede fra patten, se tabel 1. Det kan derfor ikke afvises, at berøring mellem stickens måleområde og organisk materiale kan have påvirket testresultatet. Dog kan det heller ikke udelukkes, at søer med ketonstoffer ≥ 0,2 mM i mælken generelt er sværere at malke end søer med < 0,2 mM. Tabel 1 viser fordelingen af søer, der var henholdsvis lette eller svære at malke i forhold til Ketolac-resultatet. ”Svær at malke” defineres, som at sticken skulle i berøring med patten for at få mælk på stickens måleområde. 

Tabel 1. Malkning af søer.

        
Tabellen viser, hvor mange af de svære malkninger, der havde en koncentration henholdsvis ≥ og < 0,2 mM. Ved de første malkninger blev det ikke noteret, hvorvidt soen var let eller svær at malke. Derfor fremgår kun 348 malkninger af tabellen, og ikke 422 malkninger, som udgjorde det samlede antal malkninger.

Som udgangspunkt var de bagerste patter lettere at malke end de forreste. Det kan eventuelt skyldes den anatomiske udformning af det bagerste pattesæt, da dette i reglen er større end det forreste. Under diegivningen blev der observeret lige stor aktivitet ved de bagerste patter, som ved de forreste. Pattegrisenes interesse for patterne vurderes derfor ikke at spille ind på ovenstående.

Afhængig af, hvornår der testes i forhold til malkningen hos kvæg, kan der ses forskellige BHB-koncentrationer i mælken. Hos kvæg ses de højeste koncentrationer mellem malkningerne, og de laveste under selve malkningen [14]. Det vides endnu ikke, hvorvidt dette gør sig gældende hos søer. Der er ikke taget disse hensyn i denne undersøgelse.

Precision Xceed

Af tabel 2 fremgår det, hvilke koncentrationer der blev målt med henholdsvis Precision Xceed (trippelbestemmelser) og Randox Ranbut.

Tabel 2. Oversigt over resultaterne af de to analysemetoder.

        
Som det fremgår af tabel 2, overestimerer begge målemetoder generelt det reelle (tilsatte) indhold i takt med stigende koncentrationer. Det kan skyldes, at de tilsatte værdier er angivet i fuldblodsværdier, mens analyseresultaterne (i tabel 2) er angivet i blodplasmaværdier. Der ses således en høj linearitet og korrelation, når de målte værdier for henholdsvis Presicion Xceed og Ranbut Randox sammenholdes med den beregnede plasmakoncentration, jf. figur 8.

Figur 8. Grafen viser den lineære sammenhæng mellem værdierne målt med Precision Xceed, Randox Ranbut og den tilsatte mængde af BHB i blodet (omregnet til plasmaværdier)

Brugervenlighed og driftsøkonomi

Der er indsat forskellige kontrolforanstaltninger, når man analyserer blodet ved brug af Precision Xceed. Eksempelvis afgiver apparatet en biplyd, når der er tilsat nok blod til teststrippen, og analysen påbegyndes. Displayet er letlæseligt, og apparatets størrelse gør det let at have med rundt. Ifølge Houe, 2009 [4] koster Precision Xceed-apparatet kr. 125,00 inkl. moms. Teststrippene til måling af BHB købes separat og koster kr. 120,00/10 stk. inkl. moms [3]. Den enzymatiske analysemetode er væsentlig mere kostbar på Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet. Det er altså både billigere og hurtigere at analysere blodet ude i stalden. Ulempen ved Precision Xceed i forhold til den enzymatiske analysemetode er dog, at Precision Xceed kun opgiver én decimal. Der rundes altså henholdsvis op eller ned på analyseresultatet, hvilket kan risikere at resultere i falskpositive/falsknegative resultater i enkelte tilfælde. Således målte Precision Xceed et indhold på 0,0 mM ved koncentrationen på 0,1 mM ved alle tre målinger på én af de fire grise.

Det er endnu uklart, ved hvilken koncentration søer vil udvise kliniske symptomer på ketose. For at Precision Xceed skal være anvendeligt til detektion af ketose blandt søer i praksis kræves det, at klinisk ketose blandt søer medfører udskillelse af BHB på ≥0,1 mM. Ligeledes er det uklart, hvorvidt måleusikkerhederne ved de lave koncentrationer vil få betydning for apparatets endelige anvendelse i praksis.

Det konkluderes, at der kunne observeres farveændringer ved brug af Ketolac på somælk. Testen er brugervenlig, men tidskrævende. På nuværende tidspunkt er der mange ukendte faktorer, som kan påvirke resultatet. Disse faktorer bør afklares, før brugen af Ketolac, som diagnostisk værktøj, kan anbefales til søer.

Precision Xceed er ligeledes meget brugervenlig. Lineariteten i koncentrationsmålingerne fra Precision Xceed ligger tæt på dem, man ser ved en enzymatisk laboratoriemetode. Precision Xceed lever dermed fuldt op til målinger udført med den standardmetode, der benyttes i dag. Resultatet angives med en decimal, og det er formentligt grunden til, at koncentrationen på 0,1 mM blev målt til 0,0 mM ved én af de fire grise. Risikoen for målefejl vil altid forekomme, og statistisk vurderes den fundne afvigelse ikke at have betydning for den samlede, konklusive godkendelse af testen. Dog må det ligeledes konkluderes, at en forudsætning for anvendelse af dette apparat i praksis vil være, at søer med ketose har BHB-koncentration i blodet på minimum 0,1 mM, hvilket i dag ikke er afklaret.

Afprøvning: 1038 og 1065

Samtlige søer i undersøgelsen vedrørende Ketolac blev huldvurderet ved indsættelse i farestalden, samt ved fravænning. Huldet blev vurderet en skala på 1-4, hvor 4 var fed og 1 var meget mager.

 
  Figur 9. Figuren angiver, hvilke kriterier der gjorde sig gældende for huldvurderingen – billeddatabasen nr. 2255