Undersøgelse af fortyndingseffekt af ornesæd til koncentrationer på 2,3 mia., 1,5 mia. og 1,0 mia. sædceller i sæddoser på 80 ml

Sæddoser, som anvendes til inseminering, indeholder i dag i gennemsnit 2,0 mia. bevægelige sædceller fortyndet til cirka 80 ml, hvilket svarer til et totalt indhold på cirka 2,3 mia. En anden igangværende afprøvning skal afklare, om inseminering med 1,0 mia. sædceller er tilstrækkeligt til at opnå et tilfredsstillende antal totalfødte grise pr. kuld og faringsprocent. Inseminering med det lavere antal sædceller vil medføre en hurtigere genetisk fremgang, idet flere sæddoser kan produceres ud fra samme sædopsamling. Desuden kan der opnås besparelser i produktionen af sæddoser. Anvendelse af et lavere antal sædceller pr. inseminering vil medføre, at volumen af sæden skal reduceres, eller at fortyndingsgraden skal øges.

Ved anvendelse af mindre volumen sæd vil eventuelt tilbageløb af sæd have større betydning og eventuelt påvirke reproduktionsresultaterne negativt. Det ville derfor være ønskeligt at kunne beholde den nuværende anvendte volumen sæd og dermed fortynde sæden kraftigere.

Inden for sædforskning har det gennem de senere år været diskuteret, i hvor stor udstrækning sæd kan tåle at blive fortyndet. Udenlandske undersøgelser har vist, at sædceller tager skade ved meget kraftig fortynding, både hvad angår motilitet og vitalitet ([1], [2], [3]). Vitalitet, som er andelen af membran intakte sædceller, er korreleret til frugtbarhed (Medd. nr. 564).

Der er således tales om en "fortyndingseffekt". Derved menes, at sæd kan fortyndes til en vis grænse. Såfremt denne grænse overskrides tager sædcellerne skade. Hvor denne grænse er vides ikke. Endvidere spiller fortynderen formentlig også en rolle således, at grænsen ikke er ens for alle fortyndere til ornesæd. Endvidere kan skaderne i forbindelse med kraftig fortynding muligvis mindskes ved tilsætning af ekstra sædplasma, idet det tyder på, at visse stoffer fra sædplasma er essentielle i en vis koncentration.

Såfremt den igangværende afprøvning viser, at et lavere antal sædceller kan anvendes til inseminering, kan det medføre, at sæddoser fremover muligvis skal fortyndes mere end normalt. Dog er fortyndingsgraden meget mindre end ved førnævnte studier af kraftig fortynding ([1], [2], [3]).

Formålet med afprøvningen var at undersøge, om sædens motilitet og vitalitet blev påvirket ved fortynding til koncentrationer på henholdsvis 2,3 mia., 1,5 mia. og 1,0 mia. sædceller pr. insemineringsdose.

To ejakulater fra otte orner blev opsamlet på forskellige dage. Ud fra hvert af de 16 ejakulater blev der produceret sæddoser med forskellig koncentration af sædceller (tabel 1).

Tabel 1. Oversigt over grupper i afprøvningen

Fortynding af sæden

Umiddelbart efter opsamling af ejakulatet blev koncentrationen i råsæden bestemt ved hjælp af fotometri. En råsædsprøve på 250 µl blev fortyndet 1:40 i EDTA fortynder og koncentrationen blev målt med Corning 254 (Sherwood Scientific Ltd., Manchester, UK). Motiliteten blev bestemt i henhold til ”Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer”.

Råsæden blev initialfortyndet senest ½ time efter opsamling. Sæden blev fortyndet til den ønskede koncentration således, at doserne indeholdt henholdsvis 2,3 mia., 1,5 mia. og 1,0 mia. motile sædceller i 80 ml. Fra hvert ejakulat blev to sæddoser opbevaret på ornestationen til senere motilitesundersøgelse, mens fire doser blev analyseret på Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole med flowcytometri. Alle doser blev opbevaret ved 16-18 grader celsius indtil analyse.

Analyse af sæddoser

Vitalitet af sædcellerne blev undersøgt ved flowcytometri 1, 24, 48 og 72 timer efter produktion af sæddoserne. Flowcytometrisk analyse af sæddoserne blev udført som beskrevet af Christensen (5). Fra hver sæddose blev udtaget 50 µl, som blev fortyndet 1:10 i EDTA. Fra den fortyndede sædprøve blev udtaget 50 µl, som blev tilsat et analyserør. Efter fem minutters indfarvning blev prøven analyseret i flowcytometeret.

Bestemmelse af motilitet blev udført efter reaktivering af sæden i henhold til ”Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer” . Motiliteten blev undersøgt ved mikroskopi 24 og 72 timer efter produktion af doserne.

Statistik

Analyse af motilitet og vitalitet blev udført med PROC MIXED i SAS v. 8.02. Orne og forsøgsdag indgik som tilfældig effekt, tid og gruppe indgik som systematisk effekt.

Motiliteten var ikke forskellig for de tre grupper efter 24 timer (tabel 2). Efter 72 timer var motiliteten for gruppe 3 faldet til 71 pct., hvilket var statistisk sikkert forskelligt fra gruppe 1 og 2. Årsagen til den observerede forskel kan være, at små forskelle i motilitet bliver mere fremtrædende efter 72 timers opbevaring, og derved sås det kraftige fald ved 72 timers undersøgelsen.

Tabel 2. Estimater for motilitet med angivelse af statistisk sikre forskelle

Estimatet for vitaliteten var i gennemsnit 84,2 pct. med en standardafvigelse på 0,86. Der blev ikke fundet en ændring i vitalitet indtil 72 timer efter produktion af doserne. Forskellene mellem grupperne varierede mellem ejakulaterne. Forskellene var fra -1,7 til 4,4 procentenheder. Forskellene mellem grupperne var ikke statistisk sikre, men der var dog en tendens til, at vitaliteten faldt ved større fortyndingsgrad (p=0,056). Data tyder imidlertid på, at enkelte ejakulater bedre kunne tåle den kraftige fortynding end andre, idet forskellene mellem grupperne var større for nogle ejakulater.

Mellem grupperne var det største fald i vitaliteten 4,4 procentenheder. For råsæd betyder et fald på 10 procentenheder, at totalfødte grise pr. kuld falder cirka 0,3 grise (Medd. nr. 564). Hvorvidt denne sammenhæng også gælder for vitaliteten for sæd fra sæddoser vides ikke. Forskellene var dog så små, at det ikke forventes at få betydning for antal totalfødte grise pr. kuld.

En teori bag begrebet fortyndingseffekt er, at visse stoffer fra sædplasma er nødvendig i en vis koncentration, og ved den kraftige fortynding findes de essentielle stoffer i en for lav koncentration, - også kaldet "dilution-effect". Det vides ikke, hvor meget de enkelte ejakulater i denne afprøvning er fortyndet, kun hvilken koncentration ejakulaterne blev fortyndet til. Hvorvidt der er en direkte sammenhæng mellem den observerede fortyndingseffekt og fortyndingsgraden anvendt til produktion af doser, kan denne afprøvning derfor ikke afklare. Der blev i denne afprøvning fundet en effekt på motiliteten, men det skal dog holdes in mente, at undersøgelsen af motiliteten ikke var blindet, og at datamaterialet var lille.

Der kunne ikke påvises forskelle i vitalitet, hverken mellem koncentrationerne eller fra 1-72 timer efter fortyndingen. Resultaterne tyder således på, at fortyndingsgraden ikke i sig selv har en skadelig indvirkning på sædcellens membraner, men at motiliteten bliver påvirket negativt. Årsagen til den nedsatte motilitet kendes ikke.

Det kan således ikke anbefales at fortynde sæden til cirka 1,0 mia. bevægelige i 80 ml, idet resultaterne tyder på en negativ effekt på sædens motilitet. Dog kan en kraftig fortynding måske senere anvendes, såfremt metoder udvikles til at identificere de ejakulater som kan tåle den kraftigere fortynding.

Deltagere:
Statistiker Mai-Britt Friis Nielsen, Landsudvalget for Svin.
Søren Jørgensen, Hatting-KS.

Afprøvning nr. 719