Undersøgelse af Nucleocounter SP-100 ved produktion af sæddoser

På DanAvls KS-stationer anvendes i dag fotometer (Corning 254) til bestemmelse af koncentrationen af sædceller i råsæd. Denne bestemmelse danner grundlag for fortynding af sæd til produktion af sæddoser.

En afprøvning af Nucleocounter SP-100 (SP-100) til koncentrationsbestemmelse er afsluttet (Medd. nr. 613). Instrumentet har vist sig velegnet til at bestemme koncentrationen af råsæd og er cirka dobbelt så godt som Corning 254. Instrumentet kan derfor muligvis anvendes som alternativ til nuværende metode (fotometri) til koncentrationsbestemmelse af råsæd i forbindelse med produktion af sæddoser.

Tidligere undersøgelser har vist, at SP-100 har lav variation ved koncentrationsbestemmelse (Medd nr. 613). Imidlertid vil fortynding af sæden tillige bidrage med variation, som medfører forskelle mellem sæddoser fra forskellige ejakulater (batch). I hvor stor grad andre procedurer bidrager til variationen mellem forskellige batch vides ikke.

Formålet med afprøvningen var at fastlægge variationen mellem forskellige batch ved anvendelse af SP-100 til koncentrationsbestemmelse af råsæd. Som primær parameter blev anvendt det totale indhold af sædceller i sæddoser.

Til afprøvningen blev udtaget prøver fra 126 ejakulater. Inden udvælgelsen blev koncentrationen i ejakulaterne bestemt med fotometer. Ejakulaterne blev udvalgt ud fra fotometerværdien, således at ejakulater med forskellig råsædskoncentration var repræsenteret. De udvalgte ejakulaterne blev inddelt i tre grupper med fotometerværdi på henholdsvis under 30, 30-55 og over 55, således at der var lige mange ejakulater i hver gruppe.

Initialt blev råsædskoncentrationen bestemt med fotometri og motiliteten med mikroskopi. Koncentration og motilitet blev bestemt ud fra ”Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer" (Landsudvalget for Svin, 2003).

Koncentrationsbestemmelse med Nucleocounter SP-100

Efter koncentrationsbestemmelse med fotometer blev koncentrationen bestemt med Nucleocounter SP-100 (SP-100) (Chemometec A/S, Allerød, Danmark) som dobbeltbestemmelse.

Koncentrationsbestemmelse med SP-100 blev udført i henhold til vejledning (Chemometec, 2003). Initialt blev 50 µl råsæd udtaget med FinnPipette (Labsystems, Helsinki, Finland) og afsat i bunden af en prøve-kop (Chemometec A/S). Efterfølgende blev 10,0 ml Reagent S100^© (Chemometec) tilsat med en Dispensette III (Brand, Wertheim, Tyskland). Reagent S100^© blev dispenseret, således at det automatisk blev blandet med sæden. Umiddelbart herefter blev en prøve opsuget med en SP-1 kassette (Chemometec A/S) og analysen blev foretaget i apparatet. Såfremt der ved analysen fremkom en luftboble i billedet på computeren, blev den pågældende analyse lavet om.

Produktion af sæddoser

Sæden blev fyldt i doser med et tilsigtet indhold på gennemsnitligt 2,43 mia. pr. dose. Sæden blev fortyndet ud fra første bestemmelse med SP-100. Efter bestemmelse af koncentrationen med SP-100 blev ejakulatet vejet, og volumen bestemt ud fra en densitet på 1,03 g pr. ml råsæd. Sæden blev efterfølgende initialfortyndet til en koncentration på 88,8 mio. sædceller pr. ml. Til hver sæddose blev tilsat 56 ml fortynder. Efterfølgende blev tilsat 24,5 ml initialfortyndet sæd. Tilsætningen af intitalfortyndet sæd med fyldemaskinen blev kalibreret mellem hver batch.

Undersøgelse af sæddoser

Efter produktion af sæddoserne blev to tilfældige sæddoser udvalgt. Sæddosernes volumen blev bestemt ved vejning under antagelse af en densitet på 1,02 g pr. ml færdigfortyndet sæd, og koncentration og vitalitet blev bestemt med flowcytometri. Analysen blev foretaget som enkelt bestemmelse af hver sæddose i henhold til ”Den korte vejledning i anvendelse af flowcytometri til undersøgelse af ornesæd” (Christensen, 2003).

Statistik

Indhold af sædceller pr. sæddose er analyseret deskriptivt. Præcisionen ved dobbeltbestemmelse af råsædskoncentrationen med SP-100 blev analyseret med Proc Mixed i SAS v. 8.02. Analysen blev udført på utransformerede data. Idet data ikke var normalfordelt var der en risiko for, at estimatet for præcisionen ikke var helt korrekt.

Præcisionen for dobbeltbestemmelser med SP-100 blev sammenlignet med tidligere opnåede præcision (Medd. nr. 613). Sammenligningen blev gennemført ud fra konfidensintervallet for variationskoefficienten.

Det var ikke muligt at udtage tilstrækkelig antal ejakulater med høj koncentration, og der var i datamaterialet således kun fem ejakulater med en fotometerværdi over 55.

Indhold af sædceller pr. sæddose

Ved kontrol af sæddosernes volumen fandtes, at doserne indeholdt fra 73,7 ml til 100,5 ml sæd (tabel 1). Ved produktionen af sæddoser tilsættes først cirka 56 ml fortynder, hvorefter der tilsættes 25 ml initialfortyndet sæd. Hvorvidt den førnævnte afvigelse fra det ønskede indhold på 81 ml skyldtes en fejl ved tilsætningen af fortynder eller initialfortyndet sæd vides ikke. Spredningen på volumen af doserne var 2,0 g, hvilket betyder, at 95 pct. af doserne indeholdt 76,2 til 83,2 ml sæd. Det var overraskende, at spredningen var i den størrelse, idet fylde-/tappeanlægget anses for at være præcis. Ved fyldning af sæddoser blev fortynder og initialfortyndet sæd tilsat separat. Såfremt forskellene mellem doser skyldtes tilsætningen af fortynder, betyder forskellene mellem doserne ikke noget for det totale indhold af sædceller pr. dose. Datamaterialet tyder dog på en sammenhæng mellem volumen af doserne og det totale indhold af sædceller. Dette betyder, at forskellene mellem volumen af sæddoserne til en vis grad kunne skyldes tilsætningen af initialfortyndet sæd.

Tabel 1. Beskrivende analyser af volumen af sæddoser og indhold af sædceller pr. dose

Indholdet af sædceller pr. sæddose var i gennemsnit 2,59 mia. Spredningen indikerer, at 95 pct. af en batch, produceret efter den anvendte protokol, vil indeholde ± 14 pct. Generelt kommer bidragene til variationen mellem batch både fra koncentrationsbestemmelsen med SP-100, vejning af ejakulat, blanding af ejakulat og påfyldning på doser. Den største variation menes at komme fra påfyldningen af sæd på doser, idet relativt store forskelle i volumen mellem doser inden for samme batch har været observeret. Endvidere er det observeret, at fyldemaskinen til tider har været svær at kalibrere. Dette gav sig udslag i, at det dispenserede volumen varierede forholdsvis meget mellem udmålingerne ved kalibreringen. Det kan således ikke konkluderes, at spredningen i procent også vil gælde ved produktion af doser, hvor et andet volumen initialfortyndet sæd anvendes. Resultaterne tyder endvidere på, at forskellen mellem batch er større for nogle dage.

Det tilsigtede indhold af sædceller var 2,43 mia., mens det opnåede gennemsnit var 2,59 mia. Afvigelsen svarer til 6,6 pct. i forhold til det forventede indhold. Årsagen til denne afvigelse kendes ikke.

Evaluering af SP-100

Ved en tidligere afprøvning af SP-100 (Medd. nr. 613) fandtes flere analyser, hvor der i selve tælleområdet var luftbobler, der forstyrrede koncentrationsbestemmelsen. Der blev i denne afprøvning ikke fundet analyser med luftbobler i tælleområdet.

Ved den tidligere afprøvning af SP-100 anvendtes kassetter med en kammerdybde på cirka 100 µm. Dybden blev målt med en nøjagtighed på ± 0,1 µm. Målingen blev angivet på kassetterne med intervaller på 4 µm. I denne afprøvning anvendtes kassetter med dybdeangivelse med intervaller på 2 µm. Dybdeangivelsen af selve kammeret i kassetten er derved blevet mere præcis. I denne afprøvning var variationskoefficienten (CV) ved gentagelse af koncentrationsbestemmelse af samme sædprøve (præcisionen) 2,5 pct. Ved den tidligere afprøvning var CV 3,8 pct., som er statistisk sikkert (p<0,05) højere, end hvad der blev fundet i denne afprøvning.

Præcisionen af SP-100 er blevet bedre i forhold til, hvad der er fundet ved tidligere undersøgelser. Dette skyldes formentlig den større præcision i angivelse af kammerdybden. Ved fortynding og fyldning af sæd på doser blev der opnået et gennemsnitligt indhold, som var større end forventet. Årsagen hertil kendes ikke. Ved produktion af sæddoser vil 95 pct. af doserne indeholde ± 14 pct. af det opnåede indhold. Dette menes at gælde, såfremt fyldemaskinen skal dispensere 25 ml initialfortyndet sæd.

Afprøvning nr. 765