Undersøgelse af effekten af opbevaringstid på ½, 1 og 2 timer for ejakulater inden fortynding – måling af vitalitet og motilitet

På KS-stationerne er der ved spidsbelastning et stort arbejdspres, både for tapperne i stalden og for medarbejderne i laboratoriet. I henhold til regler for avl, drift og smittebeskyttelse [1] skal et ejakulat være fortyndet senest ½ time efter opsamling. Det ville lette arbejdsgangen og tidspresset, hvis grænsen for fortynding af ejakulatet kunne udvides.

Der er ikke tidligere beskrevet studier af effekten af få timers opbevaring i forhold til fortynding straks efter opsamling. Et studie udført under andre forhold end der anvendes i Danmark viste ikke nogen negativ effekt af en opbevaringstid på 24 timer inden fortynding i forhold til at fortynde ejakulatet straks efter tapning [2].

Afprøvningen skulle afklare, om der kunne påvises en effekt ved opbevaring af ejakulatet i henholdsvis ½, 1 og 2 timer inden initialfortynding. Som parametre anvendtes sædens vitalitet målt med flowcytometri og motilitet vurderet ved hjælp af mikroskopi. Vitalitet og motilitet blev målt henholdsvis vurderet umiddelbart efter fortynding og efter 72 timers opbevaring ved 16-18 grader celsius.

Afprøvningen blev gennemført på en KS-station. I afprøvningen indgik 77 ejakulater opsamlet over en periode på 3½ måned. Ejakulaterne blev delt i tre lige store dele til henstand ved stuetemperatur i forskellig tid inden initialfortynding (tabel 1).

For at undgå for lille volumen af råsæd i hver af grupperne blev alle ejakulaterne udvalgt, således at mængden af råsæd var større end 130 gram. Ejakulatet skulle kunne godkendes til salg fra KS-stationen [1]. Fra hver af grupperne blev produceret mindst fem sæddoser indeholdende 2,0 mia. motile sædceller i cirka 80 ml. To tilfældigt udvalgte sæddoser blev straks efter produktion lagt til opbevaring ved 16-18 grader celsius. Den ene sæddose blev undersøgt straks efter produktionen, mens den anden blev undersøgt cirka 72 timer efter produktion. De to sæddoser blev undersøgt med flowcytometri og bagefter blev sæden reaktiveret [1] og motiliteten bestemt ved hjælp af mikroskopi [1]. Afprøvningens omfang var dimensioneret på baggrund af analyser af vitaliteten - men ikke motiliteten.

Tabel 1. Henstandstid for ejakulaterne inden for de tre grupper

Produktion af sæddoser

Efter tapning blev ejakulatet vejet og motiliteten i råsæden bestemt [1]. Efterfølgende blev en prøve på cirka 2 ml råsæd udtaget til flowcytometrisk analyse [3]. Inden flowcytometrisk analyse blev ejakulatet delt i tre lige store dele og hældt på rene plastdunke. Dunkene blev opbevaret ved stuetemperatur. Resultatet fra den flowcytometriske analyse blev, sammen med volumen af råsæd og motiliteten, anvendt til at beregne den nødvendige fortyndingsgrad til initialfortynding. Efter at sæden havde stået i henholdsvis ½, 1 og 2 timer, blev sæden fortyndet til cirka 80 mio. motile sædceller pr. ml (initialfortynding) med 35 grader varm EDTA-ornesædsfortynder (Hatting-KS, Horsens, Danmark). Efter initialfortynding skulle sæden fyldes på doser. Tiden fra initialfortynding til sæden blev fyldt på doser kunne variere, hvilket er i overensstemmelse med reglerne [1].

Undersøgelse af sæddoser

Hver sæddose blev undersøgt for sædens vitalitet, motilitet og koncentration. Indledningsvist blev sæddosen vejet, hvorefter sæden blev blandet grundigt ved at vende dosen mindst fem gange. Efterfølgende blev dosen åbnet og to prøver á cirka 10 ml blev hældt på 10 ml NUNC-rør (Biotech Line, Slangerup, Danmark). Sæden, fra det ene NUNC-rør blev reaktiveret og motiliteten for sæden blev undersøgt [1]. Sæden fra det andet NUNC-rør blev analyseret ved hjælp af flowcytometri.

Til flowcytometrisk analyse blev udtaget en prøve på 50 µl sæd fra NUNC-røret. Prøven blev udtaget med FACSCount pipette (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og tilsat 450 µl EDTA-ornesædsfortynder i et 2,0 ml PP-rør (Hounisen, Risskov, Danmark). Efter grundig blanding blev 50 µl af den fortyndede sæd udtaget og tilsat et sperm count rør (analyserør) (BD Biosciences). Analyserøret skulle inden analysen forberedes, ved at whirlmixe analyserøret fem sekunder med bunden opad, fem sekunder med bunden nedad og derefter tilsættes 20 µl SYBR-14/PI (BD Biosciences). Efter tilsætning af sædprøven til analyserøret blev prøven indfarvet i fem minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev den indfarvede prøve analyseret i ”FACSCount AF” flowcytometeret.

Statistisk analyse

Data for vitalitet blev analyseret med Proc Mixed. I modellen indgik gruppe og analysetidspunkt for sæddosen som klassevariabler og vitaliteten i råsæd indgik som covariater, mens ejakulat indgik som tilfældig effekt. Forskelle i motiliteten blev analyseret ved anvendelse af Wilcoxon Rank Sum Test. Til alle analyser blev anvendt SAS v. 8.02.

Afprøvningen var dimensioneret på baggrund af tidligere målinger af vitalitet.

Undersøgelsen viste en klar sammenhæng mellem opbevaringstid af ejakulatet og vitalitet i sæddoserne (tabel 2). Der var vekselvirkning mellem gruppe og analysetidspunkt for sæddoserne. Vekselvirkning består i, at der sås forskel mellem analysetidspunktet for sæddoserne i gruppe 1, hvilket ikke var tilfældet i gruppe 2 og 3.

Tabel 2. Estimater for vitaliteten for de forskellige grupper til forskellige analysetidspunkter

Med hensyn til motiliteten viste undersøgelsen ingen forskel mellem grupperne (tabel 3), mens der ved undersøgelse af vitaliteten viste sig en beskyttende effekt af 2 timers opbevaring i forhold til ½ times opbevaring. Det har ikke tidligere i litteraturen været angivet, at ornesæd skulle opnå bedre befrugtningsevne ved at øge opbevaringstiden for råsæden inden fortynding. Det er derfor overraskende, at flere sædceller havde intakt membran, når opbevaringstiden blev øget. Som kontrolgruppe i undersøgelsen blev anvendt ½ times opbevaring inden fortynding, idet dette er grænsen for, hvad der er tilladt i produktionen på DanAvls KS-stationer. Hvordan vitaliteten ville have været for sæd, der fortyndes umiddelbart efter tapning, kan denne afprøvning ikke afklare.

Tabel 3. Fordelingen af ejakulater med motilitet 90, 80, 70 og <70 for de forskellige grupper

Formålet med afprøvningen var at afklare, hvorvidt forøget opbevaring medførte en negativ effekt på sædcellernes vitalitet og motilitet. Der blev i forsøget undersøgt opbevaringstid på både ½, 1 og 2 timer. Forventningen var, at resultaterne fra gruppen med 2 timers opbevaring skulle vise en kraftigere negativ effekt end gruppen med 1 times opbevaring. Modsat forventningerne blev der påvist en positiv effekt ved længere tids opbevaring. Da der ikke i litteraturen er beskrevet en positiv effekt af lang tids opbevaring af råsæd inden fortynding, opfattes resultaterne mere som en manglende negativ effekt end en positiv effekt af opbevaring af råsæden i 2 timer frem for 1 time inden fortynding.

Årsagen til, at resultaterne for sæden vitalitet viste en beskyttende effekt af 2 timers opbevaring af sæden kendes ikke. Det kan dog skyldes, at den længere opbevaringstid for sædcellerne i deres naturlige miljø i sædplasma har en beskyttende effekt på membranerne. Inden ejakulation findes sædcellerne i bitestiklen. Der er stor forskel på både koncentrationen af sædceller, det osmotiske tryk og indholdet af ioner i sædceller fra bitestiklen til den ejakulerede sæd [4]. Disse forskelle som sædcellerne udsættes for ved ejakulationen udlignes formentlig ikke straks efter ejakulation, men tager et stykke tid. Det kunne være en beskyttende faktor for sædcellernes membraner, hvis opholdet i sædplasma blev forøget inden sæden blev fortyndet, da sædcellerne på den måde har længere tid til at vænne sig til det nye miljø. Den optimale opbevaringstid af sæden kendes dog ikke, da for lang tids opbevaring forventes at have en negativ effekt på sædcellerne motilitet. Mens en øget opbevaringstid kan virke positivt på sædcellerne membraner, kan det samtidig måske virke negativt på andre af sædcellens funktioner.

Afprøvning viste en stigning i sædcellernes vitalitet, når opbevaringstiden blev øget fra ½ time til 2 timer, men der kunne ikke påvises et fald i motiliteten. Dette resultat tolkes som, at der ikke er nogen negativ effekt af at opbevare råsæd længere tid end ½ time. Dog skal der tages forbehold for, at kun vitaliteten og motiliteten er undersøgt. Sædceller er kun befrugtningsdygtige, hvis de er intakte og alle processerne i sædcellerne fungerer optimalt. Der kan ikke ud fra denne afprøvning siges noget om sædens befrugtningsevne. Det anbefales derfor, at grænsen for opbevaringstiden for råsæd inden fortynding i fremtiden udvides fra den nuværende anbefaling på en ½ time til 1 time fra tapning.

Deltagere
Hatting-KS, Ringsted afdeling, Køgevej 103, 4100 Ringsted
Statistiker: Mai Britt Nielsen, Landsudvalget for Svin

Afprøvning: 781