Undersøgelse af beskadigelser i sædcellers arvemateriale

Det har i mange år været et ønske fra KS-stationer i hele verden at have en metode, der kan måle sædens frugtbarhed før insemineringen. Der er således udviklet mange metoder, hvoraf analyse af sædens arvemateriale (SCSA) samt måling af andelen af levende sædceller blot er få blandt mange laboratorieundersøgelser.

SCSA blev udviklet i starten af 80’erne [1]. Metoden har i mange år fundet stor anvendelse inden for analyse af sæd fra mennesker, hvor det har været vist, at beskadigelser i arvematerialet (DNA) også hænger godt sammen med dårlig frugtbarhed [2]. Metoden til måling af SCSA omfatter analyse af cirka 10.000 sædceller pr. måling. En måling med SCSA giver et resultat for graden af beskadigelser (DNA fragmentationsindeks), standardafvigelsen for DNA fragmentationen af sædcellerne for hele målingen (SD-DFI) samt en måling af andelen af celler der tager imod meget farve (High DNA stainability eller HDS), som giver en indikation af, at sædcellerne er umodne.

SCSA-målingen er en analyse af, hvor normalt sædcellernes arvemateriale er pakket i sædcellen [3]. Hvis arvematerialet er beskadiget i forbindelse med pakningen i sædcellen, viser analysen, at DNA fragmentationsindekset er højt. Samtidig kan sædcellerne være meget uens, hvorved også SD-DFI stiger. Hvis sædcellerne er meget umodne – det vil sige ikke færdigdannet - farves sædcellerne i metoden meget intenst HDS stiger. SCSA-metoden giver således et forholdsvis samlet billede af, om arvematerialet i sædcellerne er normalt eller unormalt.

Måling af andelen af levende sædceller er ligeledes en velbeskrevet analyse [4]. Sædcellerne bliver farvet med et farvestof, som udelukkende kan komme ind i sædcellen, når sædcellen er død. Metoden har tidligere været afprøvet i Danmark og kan kædes sammen med reduceret kuldstørrelse [5].

Formålet var at undersøge, om analysen af arvematerialet i ornesædceller målt med SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) sammen med andelen af levende sædceller kunne forklare ornens frugtbarhed, udtrykt som totalfødte grise pr. kuld og faringsprocent.

Afprøvningen blev gennemført som et samarbejdsprojekt med Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet under projektet ”Årsager til høj og lav frugtbarhed hos tyre og orner”. Afprøvningen var finansieret af DanAvls KS-stationer, Dansire samt Dansk Svineproduktion.

Afprøvningen omfattede tre ejakulater fra hver af 124 orner fordelt på 63 Landrace (L) og 61 Yorkshire (Y). Sæddoser fra disse orner blev produceret i henhold til normale standarder for DanAvls KS-stationer [6]. Fra hvert ejakulat blev udtaget sæddoser til laboratorieanalyse, mens resten blev solgt til svinebesætninger. For hvert af ejakulaterne blev indsamlet resultater for omløb og kuldstørrelse gennem DanAvls avlsdatabase. Laboratorieundersøgelserne omfattede analyse af andelen af levende sædceller samt analyse af sædcellernes arvemateriale (SCSA). Analyser af andelen af levende sædceller samt SCSA blev gennemført dag 0, 1, 2 og 3 efter produktion af sæddosen. Sæden var ved opbevaringen lagret ved 16-18 grader celsius.

Til SCSA-analysen blev en prøve af sæden nedfrosset ved hvert af analysetidspunkterne. Selve analysen blev gennemført senere.

Proceduren for laboratorieanalyserne er beskrevet i detaljer i litteraturen [7].

Statistisk analyse

En enkelt orne blev taget ud af data, idet sæden fra denne ikke havde været anvendt til løbninger i avls- eller opformeringsbesætninger, hvorfor data fra disse løbninger ikke kunne indhentes. Yderligere blev otte orner udtaget, da registreringer af sædanalyserne var mangelfulde. De statistiske analyser omfattede samlet 63 Landrace og 61 Yorkshire orner.

De fire sædkvalitetsmål: Andelen af levende sædceller, DFI, SD-DFI samt HDS blev analyseret hver for sig i en generaliseret lineær model med tid og race som systematiske effekter. Orne samt ejakulat indgik som tilfældig effekt.

Totalfødte grise pr. kuld blev analyseret i en generaliseret lineær model med systematiske effekter af andelen af levende sædceller, DNA fragmentationsindeks (DFI), standardafvigelsen for DNA fragmentationen af sædcellerne for hele målingen (SD-DFI), måling af andelen af celler der tager imod meget farve (High DNA stainability eller HDS), farrace, morrace, kuldnummer, samt sædens alder og tilfældigeffekt af orne samt ejekulat. Omløbere blev analyseret i en logistisk model med gentagne målinger for orne.

Resultater og diskussion

Analyse af andelen af levende sædceller og sædcellernes arvemateriale

Generelt sås et fald i andelen af levende sædceller fra dag 0 til 3 (tabel 1). Faldet i andelen af levende sædceller fra dag 0 til 3 skal ses i lyset af, at måleusikkerheden for måling af sædens andel af levende sædceller normalt ligger på cirka +/- 2 for en enkelt måling. Selv om faldet er statistisk sikkert, har det ikke stor biologisk relevans i forhold til at forudsige sædens holdbarhed.

Målingerne af arvematerialet (SCSA) bestod af et DNA fragmentationsindeks (DFI), standardafvigelsen for DNA fragmentationen af sædcellerne for hele målingen (SD-DFI) samt en måling af andelen af celler der tager imod meget farve (High DNA stainability eller HDS). Resultaterne viste marginale raceforskelle mellem Landrace og Yorkshire og analysetidspunktet (tabel 1).

Tabel 1. Resultater for måling af andelen af levende sædceller (vitalitet), DNA fragmentationsindeks (DFI), standardafvigelse for DNA fragmentationen af sædcellerne for hele målingen (SD-DFI) samt en måling af andelen af celler der tager imod meget farve (High DNA stainability eller HDS)

		Analysedag efter produktion af sæden
Race		0	1	2	3
Vitalitet	Landrace Yorkshire	88,0 a 87,4 a	87,8 b 87,1 b	87,7 b 87,1 b	87,3 c 86,7 c
DFI	Landrace Yorkshire	1,19 a 2,16 a	2,11 b 2,30 b	2,21 c 2,31 b	2,44 d 2,46 c
SD-DFI	Landrace Yorkshire	24,5 a 25,2 a	25,1 b 24,9 a	25,5 c 25,7 b	25,7 c 26,0 c
HDS	Landrace Yorkshire	0,89 a 0,73 a	0,90 ab 0,75 ab	0,92 b 0,77 bc	0,96 c 0,78 c
Bogstaver med ”hævet skrift” angiver statistisk sikker forskel mellem analysedagene inden for hver race.

Analyserne viste en stor korrelation mellem sædens vitalitet og DFI, men ikke til HDS eller SD-DFI. En høj korrelation mellem DFI og vitalitet betyder i praksis, at man ikke får yderligere information ved at måle DFI, når man har resultatet for andelen af levende sædceller og vice versa. Korrelationen var ens for alle analysetidspunkterne.

Det var ikke forventet, at der ville være korrelation mellem DFI og andelen af levende sædceller, idet disse ikke umiddelbart er forbundet ud fra sædcellens normale biologi. Egenskaberne i arvematerialet blev bestemt, da sædcellen blev dannet i testiklen, mens andelen af levende sædceller kan påvirkes fra sædcellen er dannet i testiklen lige indtil selve målingen. Sammenhængen kan dog være opstået, hvis den øgede grad af DNA fragmentation opstod som følge af, at sædceller er døde i sæddosen. Når sædceller dør, frigives alle enzymer, der ligger intracellulært i sædcellen. Disse enzymer kan forårsage beskadigelse af andre sædceller, som derved hurtigere dør. Både døde sædceller og beskadigede sædceller kunne derved forårsage beskadigelse af arvematerialet. Derved bliver en stigning af DFI sekundær til andelen af døde sædceller. Om det forhold har haft indflydelse på målingerne af HDS og SD-DFI vides ikke.

Sammenhæng mellem andelen af levende sædceller, beskadigelser i arvematerialet og ornernes frugtbarhed

Fra ornerne i forsøget er i alt gennemført 30.133 løbninger i forsøgsperioden, med 15.134 fra Landrace og 14.999 var fra Yorkshire. Analyserne viste en spredning på 3,7 grise pr. kuld. Den samlede varians, der kunne forklares af ornerne, var 2,8 pct., hvilket var lidt lavere end normalt, hvor variansen var forventet at ligge på cirka 4 pct. Fra ejakulaterne, hvorfra analyserne er gennemført, er der i alt 3.015 løbninger.

Faringsprocenten for de 30.133 løbninger fra alle ornerne i afprøvningen var 77 pct. Som nævnt ovenfor var det ikke sæd fra alle sædopsamlinger, der blev analyseret. Faringsprocenten fra de sædopsamlinger, hvorfra der var gennemført målinger af sædcellernes arvemateriale og andelen af levende sædceller, var 80,3 pct. Dette betragtes som normalt, idet sæden har været anvendt i avls- og opformeringsbesætninger.

Analyserne viste, at både andelen af levende sædceller samt beskadigelser i arvematerialet (DFI) havde en sammenhæng til kuldstørrelsen. Dog var korrelationen mellem DFI og andelen af levende sædceller for høj, til at begge parametre kunne indgå i samme statistiske model. Den mest optimale statistiske model til forklaring af sædens fertilitet indeholdt DFI ved dag 1, SD-DFI ved dag 0 og HDS ved dag 3. Målingerne af både DFI, SD-DFI og HDS var korreleret mellem de forskellige analysedage, hvilket betyder at der ikke var den store forskel på, hvilken dag efter sædtapning analyserne blev foretaget.

Den mest optimale model omfattede tre forskellige måletidspunkter, formentlig fordi korrelationen mellem de tre måleparametre blev mindst, når der netop blev anvendt forskellige måletidspunkter, men det vides ikke med sikkerhed.

Det blev forsøgt at kombinere måleparametrene i udarbejdelse af et fertilitetsindeks, hvor de forskellige parametre indgik med lige vægtning til udvælgelse af orner med reduceret frugtbarhed. Det var ikke muligt at sammensætte parametrene i et indeks for sædkvalitet. En af årsagerne kan være, at der for hver race kun var cirka 60 orner. Når formålet var at udvælge de 5 pct. dårligste orner, blev antallet af orner med beskadiget arvemateriale og stor andel af døde sædceller lavt. Resultaterne indikerer således, at hvis der skal anvendes et indeks for sædkvalitet til at identificere orner med reduceret sædkvalitet, vil det formentlig være nødvendigt med mindst 100 orner inden for hver race.

I denne afprøvning var inkluderet godt 60 orner fra både Landrace og Yorkshire. Ud af de godt 120 orner havde cirka syv orner en kuldstørrelse, som var under 12,5 grise pr. kuld i gennemsnit. Kun en af disse var blandt de fem orner med lavest andel af levende sædceller. For DFI var resultaterne lidt bedre, idet tre ud af de syv orner med dårligst DFI også havde dårlig frugtbarhed.

Analyserne viste, at nogle orner havde generel god frugtbarhed, selv om prøverne viste, at arvematerialet var beskadiget eller andelen af døde sædceller var relativt stor (figur 1 og 2). Dette kan skyldes, at prøverne der blev udtaget, ikke var udtryk for ornens normale sædkvalitet, eller at målemetoden ikke er stabil nok, til at et lavt antal prøver kan identificere orner med generelt reduceret frugtbarhed.

Ingen af parametrene var forklarende for faringsprocenten, hverken opgjort direkte for de ejakulater, hvorfra målingerne var foretaget eller samlet som gennemsnit for ornerne. Dette kan skyldes, at der kun var to orner med afvigende faringsprocent, samt at årsagen til reduceret frugtbarhed for disse orner skulle findes andet steds.

Det betyder, at såvel SCSA som måling af andelen af levende sædceller kun i begrænset omfang kan identificere orner med generelt dårlig frugtbarhed. Det var forventet, at de orner med dårligste resultater i såvel SCSA som målingen af andelen af levende sædceller også havde reduceret frugtbarhed, men dette var ikke tilfældet.

Analysemetode til måling af beskadigelser i sædcellernes arvemateriale og måling af andelen af levende sædceller kunne ikke i denne afprøvning entydigt identificere de orner med dårligst frugtbarhed, idet også orner med beskadiget arvemateriale kunne have god frugtbarhed.

[1]	Evenson, D.P.; Darzynkiewicz, Z.; Melamed, M.R. (1980): Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science 240:1131-1133.
[2]	Evenson, D.P.; Thompson, L. (1991): Flow cytometric analysis of boar sperm chromatin structure as related to cryopreservation and fertility. In: Proc of Second International Conference on Boar Semen Preservation (Johnson LA, Rath D, eds) pp 165-183.
[3]	Boe-Hansen, G.B. (2005): Sperm DNA fragmentation in humans, bulls and boars. PhD Thesis, The Royal Veterinary and Agricultural University, Department of large animal sciences, veterinary reproduction and obstetrics.
[4]	Garner, D.L.; Johnson, L.A.; Yue, S.T.; Roth, B.L.; Haugland, R.P. (1994): Dual DNA staining assessment of bovine sperm viability using SYBR-14 and propidium iodide, Journal of Andrology, 15: 620-629.
[5]	Madsen, M.T.; Wachman, H.; Johansen, D.; Christensen, P. (2002): Vitalitetsbestemmelse af ornesæd ved flowcytometri. Meddelelse nr. 564, Landsudvalget for Svin.
[6]	Hansen, C. (2007): Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer. Manual nr. 4, Dansk Svineproduktion.
[7]	Boe-Hansen, G.B.; Christensen, P.; Vibjerg, D.; Nielsen, M.B.F.; Hedeboe, A.M. (2006): Assessment of sperm chromatin structure in liquid stored boar semen and correlation to field fertility - Sperm chromatin structure in the boar and fertility. Theriogenology, submitted paper.

Deltagere
Projektet blev gennemført som et samarbejdsprojekt med Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet under projektet ”Årsager til høj og lav frugtbarhed hos tyre og orner”.

Projektet var delfinansieret af DanAvls KS-stationer, Dansire samt Dansk Svineproduktion.

Arbejdet har været delvist udført af specialestuderende Dorte Vibjerg.