Undersøgelse af sædkvalitet for Duroc-orner

Ved produktion af slagtesvin i sohold anvendes i dag oftest sammenblanding af sæd fra flere forskellige orner. Denne metode antages at give en sikkerhed for, at enkelte orner med reduceret frugtbarhed ikke påvirker reproduktionsresultaterne i særlig stort omfang. Tidligere afprøvninger har vist, at frugtbarheden for produktionssæd i dag kan være rigtig god - med kuldstørrelser på knap 16 grise pr. kuld [1]. Tidligere afprøvninger har ligeledes vist, at sæd med reduceret kvalitet påvirker frugtbarheden negativt [2]. Men tidligere afprøvninger har ikke vist, hvilken effekt sæd med reduceret kvalitet har, når sæden bliver sammenblandet med sæd der har god kvalitet, Sædens kvalitet kan måles på mange forskellige måder. Normalt undersøges sæden lige efter sædopsamling med mikroskopisk vurdering af sædcellernes bevægelighed samt hvor mange af sædcellerne, der har defekter [3]. Med andre målemetoder kan sædcellerne også bedømmes med instrumenter, der kan måle sædcellernes egenskaber meget mere nøjagtigt.

De mest almindelige målemetoder omfatter måling af andelen af levende sædceller, måling af sædcellernes bevægelighed med computer assisteret sæd analyse (CASA) eller måling af andelen af defekte sædceller ved at vurdere 200 celler enkeltvis. Metoderne til måling af andelen af levende sædceller samt CASA vil i fremtiden kunne implementeres hos DanAvls KS-stationer, dersom det viser sig lønsomt, da målingen foretages med et instrument og er en forholdsvis hurtig analyse. Den manuelle tælling af andelen af defekte sædceller vil ikke kunne implementeres i produktionen af sædceller, som det ser ud i dag, da metoden er en for langsommelig metode.

Formålet med afprøvningen var at undersøge Duroc-orners sædkvalitet målt som andelen af progressivt bevægelige sædceller, andelen af levende sædceller samt andelen af sædceller med defekter. Afprøvningen skulle danne grundlag for en afprøvning af effekten af sæd med reduceret kvalitet, som er blandet med sæd der har god kvalitet.

Undersøgelsen omfatter analyser af sæd fra 97 forskellige Duroc-orner fra en enkelt KS-station. Prøverne er opsamlet fra juli til september 2007. Fra hver orne blev indsendt to sæddoser fra en enkelt sædopsamling, samt en prøve af sæd, som var fortyndet cirka 1:3 (koncentreret sædprøve). Sædprøverne blev kølet til 16-18 grader celsius inden prøverne blev sendt til analyselaboratoriet med klimastyret transport. Alle sædopsamlingerne var godkendt i henhold til normale regler for KS-stationerne [3]. Analyserne af sædprøverne omfattede analyse af antal og typen af defekter på sædcellerne, holdbarhed målt som sædcellernes bevægelighed samt andelen af levende sædceller tre dage efter sædopsamling.

Analyse af sædcellernes defekter

Fra den koncentrerede sædprøve blev udtaget cirka 5µl, som blev farvet med Eosin-Nigrosin, og efterfølgende fordelt ved udstrygning på et objektglas, således at sædcellerne lå enkeltvis og kunne vurderes separat. Hver af prøverne blev undersøgt i mikroskop ved 1.000 ganges forstørrelse. Undersøgelsen omfattede en vurdering af mindst 200 celler. Defekterne blev vurderet subjektivt og klassificeret ud fra angivelsen i appendiks 1. Defekterne blev inddelt i primær defekt på hovedet, primær defekt på halen, halekrølle, distaldråbe eller proksimaldråbe.

Analyse af sædcellernes bevægelighed

Analyse af sædcellernes bevægelighed blev udført ved anvendelse af SpermVision (computerbaseret sædanalyse - se [4] for detaljeret beskrivelse af instrumentet). Med SpermVision optages en række billeder af sædcellerne. I den sekvens af billeder bliver hver sædcelle fulgt, således at bevægeligheden for hver sædcelle kan beregnes i computeren. Alle målingerne blev gennemført med dobbeltbestemmelse.

På tredje dagen efter sædtapning blev der overført cirka 10 ml sæd fra en sæddose til et NUNC-rør. Sæden i NUNC-røret blev opvarmet i vandbad i 50 minutter ved 38 grader celsius inden analysen med SpermVision. Efter opvarmning blev der udtaget 2,3µl sæd, som blev overført til et forvarmet Leja-4 tællekammer (20 µm dybt) og analysen blev foretaget straks herefter. I analysen blev syv forskellige områder i tællekammeret videofilmet. Hver analyse omfattede i gennemsnit vurdering af bevægeligheden for cirka 400 sædceller eller flere. Bevægelige sædceller var sædceller med AOC (gennemsnitlig drejning af sædcellehovedet) ≥ 5 grader and VSL (gennemsnitlig hastighed i fugleflugtslinje lige linje fra start til slut) ≥ 9 µm/sekund, hvilket svarer til cirka 1½ gang sædcellehovedets længde.

Analyse af andelen af levende sædceller

Analysen af andelen af levende sædceller blev udført med NucleoCounter SP-100. Analysen omfatter en måling af koncentrationen af sædceller (både levende og døde), samt en måling af koncentrationen af døde sædceller i prøven. Andelen af levende sædceller beregnes ud fra disse to forskellige målinger. Analysen af andelen af levende sædceller blev gennemført som dobbeltbestemmelse.

Måling af koncentrationen af sædceller
Der blev overført cirka 10 ml sæd fra en sæddose til et NUNC-rør. Fra NUNC-røret blev afpipetteret 1,000 ml sæd med en automatpipette (FinnPipette). Den afpipetterede mængde blev fortyndet med 10,00 ml Reagent S100. En prøve af den fortyndede sæd blev overført til en målekassette (SP1 Cassette), som blev analyseret i instrumentet.

Måling af koncentrationen af døde sædceller
Fra NUNC-røret blev afpipetteret 1,000 ml sæd med en automatpipette (FinnPipette). Den afpipetterede mængde blev fortyndet med 4,00 ml EDTA-ornesædsfortynder. En prøve af den fortyndede sæd blev overført til en målekassette (SP1 Cassette), som blev analyseret i instrumentet.

Andelen af levende sædceller blev beregnet som forholdet mellem koncentrationen af døde sædceller og koncentrationen af sædceller i prøve.

Statistisk analyse

Korrelation mellem morfologi, CASA og vitalitet blev undersøgt med Princomp. Rangering af ornerne blev gennemført med individuel estimering af ornens sædkvalitet. Gode orner var dem som var blandt top 25 pct. inden for alle tre metoder. Dårlige orner var bund 5 pct. for hver af de tre parametre + de skal kunne klassificeres som en outlier i forhold til ornernes normale fordeling.

Resultaterne viste ingen klare sammenhænge mellem målingerne af andelen af levende sædceller, sædcellernes bevægelighed eller andelen af defekter på sædcellerne. Analyserne viste, at repeterbarheden for målingerne af sædcellernes bevægelighed var højere, end hvad der normalt kan ses ved analyse af sædcellers bevægelighed. Grunden til dette kan skyldes analysemetoden, hvor proceduren i selve analysen er ændret i forhold til fremgangsmåden i denne afprøvning [4]. Det kan have haft den betydning, at enkelte orner er rangeret forkert i forhold til hinanden, men generelt vil forskellene mellem orner i fremtidige undersøgelser kunne forventes at være den samme, som er set i denne afprøvning (figur 1). Repeterbarheden for måling af andelen af levende sædceller var som forventet under 3 pct. (tabel 1).

Tabel 1. Repeterbarhed for analyser af andelen af levende sædceller og analyse af sædcellernes bevægelighed

Ornernes sædkvalitet målt som andelen af progressivt bevægelige sædceller (se appendiks 1 for definition af progressiv bevægelig sædcelle) varierede meget (der var kun et ejakulat pr. orne) (figur 1). Sæden blev analyseret tre dage efter sædopsamling og sæden havde været sendt mellem to KS-stationer. Det kunne tyde på, at prøverne fra en enkelt dag var beskadiget af forsendelsen, idet resultaterne indikerede, at alle prøverne generelt havde lavere andel progressivt bevægelige sædceller end de andre dage. Selv hvis prøver fra denne dag (10 prøver) blev taget ud af opgørelsen, ville andelen af bevægelige sædceller ligge fra cirka 20 pct. for de dårligste og op til cirka 75 pct.

Til trods for at en mulig beskadigelse af sædcellerne ved forsendelsen kunne erkendes med måling af andelen af bevægelige sædceller, var det ikke muligt at genfinde dette ved måling i andelen af levende sædceller (resultaterne for hver af ornerne fremgår af figur 2). Dette kan enten betyde, at forsendelsen ikke havde påvirket sædcellerne og dermed ikke beskadiget sæden, eller at måling af andelen af bevægelige sædceller var en mere følsom parameter for måling af lettere beskadigelser af sædcellerne.

Figur 1. Resultater for hver af ornerne i afprøvningen - Y-aksen angiver andelen af progressivt bevægelige sædceller tre dage efter sædopsamling (pct.)

Figur 2. Resultater for hver af ornerne – andelen af levende sædceller tre dage efter sædopsamling.

Resultaterne for analysen af defekte sædceller viste forholdsvis mange sædceller, der havde defekter. Det synes overraskende, da sæden rutinemæssigt bliver undersøgt for andelen af defekte sædceller. Årsagen til de forholdsvis mange defekter kan skyldes, at metoden til at vurdere defekter for sædceller var langt mere detaljeret end den subjektive mikroskopiske vurdering, der blev foretaget umiddelbart i forbindelse med sædopsamlingen.

Det vil ikke med sikkerhed kunne siges, at en orne med mange defekte sædceller, eller hvis sæden har dårlig bevægelighed på tredje dagen, også med sikkerhed vil have reduceret frugtbarhed. Det antages, at dårlige resultater for en måleparameter for sædkvalitet giver en forøget risiko for ornen/sædopsamlingen om reduceret frugtbarhed. Dog vil man være mere sikker på, at frugtbarheden også er reduceret, hvis der er dårlige resultater for flere forskellige måleparametre. I denne undersøgelse var sammenhængen mellem de tre måleparametre ikke stor, hvilket i praksis betyder, at man får yderligere information ved at måle alle tre parametre frem for blot en eller to af dem. Det var forventet, at der ville være sammenhæng mellem andelen af levende sædceller og andelen af bevægelige sædceller, men resultaterne indikerer, at mange af sædcellerne, som var ubevægelige, således ikke har været døde, men beskadiget så meget, at de har ligget ubevægelige. Det kan derfor antages, at man reelt måler to forskellige kvalitetsparametre med henholdsvis bevægeligheden og andelen af levende sædceller.

Andelen af levende sædceller og andelen af bevægelige sædceller kan betragtes som en parameter, der kan forringes over tid og dermed afdække noget om sædens holdbarhed. Derimod er andelen af defekte sædceller og typen af defekter, noget der ikke bliver ændret over tid og dermed noget der formentlig betyder noget for frugtbarheden allerede mens sæden er helt frisk. Det vil formentlig være en forværrende omstændighed for frugtbarheden, hvis både andelen af normale sædceller er lav, samtidig med at enten sædcellernes bevægelighed er dårlig, eller andelen af levende sædceller er lav.

Resultaterne viste, at fire orner kunne klassificeres som værende dårlige i alle tre parametre og fem orner var gode i alle tre måleparametre. Resten af ornerne havde andre kombinationer af gode og dårlige resultater fra analyserne.

Ved fremtidige afprøvninger af sædkvalitetens indflydelse på kuldstørrelse og faringsprocent kan der ikke dannes et egentligt indeks på baggrund af de anvendte måleparametre i denne undersøgelse. Derimod kan metoderne anvendes, således at hvis man vil undersøge effekten af eks. sædcellernes bevægelighed, kan de andre målemetoder inkluderes i analyserne af sæden, således at man ikke fejlagtigt tror, at sædkvaliteten er god blot fordi man har målt sæden med en enkelt analysemetode og dermed klassificerer ornen/sæden som god på fejlagtigt grundlag.

Sædceller blev defineret som normal, hvis der ikke med 1.000 ganges forstørrelse kunne erkendes noget unormalt ved sædcellen. Sædcellehovedets omrids skulle være at normal størrelse og ikke variere tydeligt i hverken bredde, højde eller form fra omkringliggende sædceller eller være tydeligt forskellig fra en normal sædcelle (figur 4 viser en normal sædcelle).

Der blev i analyserne set efter følgende defekter

• Løst hoved (kun sædcellehoveder blev registreret - eventuelle løse haler blev ikke talt med)
• Distal cytoplasma dråbe
• Proximal cytoplasmadråbe
• Unormal hale
• • Simpel halekrølle
  • Stærkt oprullet hale
  • Knæk på halen                   
  • Defekt mellemstykke
  • Abaxial tilhæftet hale
  • Dobbelt hale
  • Dag defekt
• Unormalt hovedform
• • Pæreformet hoved
  • Bagtil tilspidset hoved
  • Smalt hoved
  • For lille hoved
  • For stort hoved
  • Kort plumpt hoved
  • Dobbelt hoved
  • Hoved af abnorm form i øvrigt                   
  • Defekt hovedbasis
• Øvrige abnormiteter ved hovedet
• • Krater defekter                  
  • Unormalt akrosom
• Både hoved og hale stærkt forandret