Der er gennemført en undersøgelse af sammenhængen mellem måling af sædcellernes bevægelse målt med SpermVision CASA System og sædens frugtbarhed. Afprøvningen blev gennemført ved måling af tre dage gammel sæd. Formålet var at bestemme:
- forskelle mellem målinger af sædcellers bevægelighed målt med SpermVision CASA System mellem forskellige sædopsamlinger fra samme orne
- sammenhængen mellem sædcellernes bevægelighed målt med SpermVision CASA system og frugtbarheden for Yorkshiresæd
- sammenhængen mellem en enkelt måling af sædbevægelighed hos en orne og hans gennemsnitlige frugtbarhed
Der blev fundet statistisk sikker sammenhæng mellem sædens bevægelsesparametre og sædens frugtbarhed. Et fald i andelen af bevægelige sædceller på 10 procentenheder resulterede i 0,37 færre fødte grise pr. kuld. Ved stigning i R-VCL (variation for bevægelseshastighed af sædcellerne) sås fald i kuldstørrelsen på 0,17 grise. Disse effekter supplerede hinanden, hvilket vil sige at de er additive.
Der blev tillige fundet statistisk sikker sammenhæng mellem faringsprocenten og sædens bevægelsesparametre. Således resulterede et fald i andelen af bevægelige sædceller på 10 procentenheder i et fald i faringsprocenten på cirka 7 procentenheder. Sammenhængen mellem sædens bevægelighed og faringsprocenten var ikke statistisk sikker mellem en måling af sæd fra en orne og samtlige sæddoser fra samme orne.
Baggrund
Produktionen af sæddoser fra DanAvls KS stationer er underlagt en række krav (regler) til kvalitetskontrol [1]. Disse regler angiver, hvorledes sæden skal undersøges og grænserne for, hvornår sæden skal kasseres. Ornesæd fra DanAvls KS-stationer undersøges med mikroskopi, hvor en laboratoriemedarbejder vurderer sædens kvalitet. Denne vurdering omfatter en samlet score for sædens bevægelighed samt sædens defekter – benævnt sædens motilitet. Denne vurdering er subjektiv. En subjektiv vurdering af sæden har lave økonomiske omkostninger, men er også behæftet med usikkerheder, da personer ikke kan ensrettes. Til trods for den lave sikkerhed for estimering af sædens motilitet, har tidligere undersøgelser vist, at denne score har sammenhæng med sædens frugtbarhed [2].
Nyere metoder gør det i dag muligt at analysere sædens bevægelighed objektivt [3]. Instrumenter til måling af sædens bevægelighed er ikke en ny opfindelse, men ældre instrumenter har ikke været i stand til at måle et større antal sædceller hurtigt, hvorved nøjagtighed og repeterbarhed for analyserne ikke har været tilfredsstillende. I dag analyseres cirka 1.000 celler mod cirka 100 celler med ældre maskiner til analyse af sædcellernes bevægelighed.
En validering af instrumentet SpermVision CASA System har vist god repeterbarhed for målinger af sædcellers bevægelighed [3].
Formålet i denne afprøvning var at estimere:
- forskelle mellem målinger af sædcellers bevægelighed målt med SpermVision CASA System mellem forskellige sædopsamlinger fra samme orne
- sammenhængen mellem sædcellernes bevægelighed målt med SpermVision CASA system og frugtbarheden for Yorkshiresæd
- sammenhængen mellem en enkelt måling af sædbevægelighed hos en orne og hans gennemsnitlige frugtbarhed
Materiale og metode
Afprøvningen omfatter resultaterne fra insemineringer fra avl- og opformeringsbesætninger. Insemineringerne blev gennemført med anvendelse af Yorkshiresæd fra 6 seks DanAvls KS-stationer. Sæd fra sædopsamlingerne anvendt i afprøvningen blev undersøgt for bevægelighed af sædcellerne.
Orner og sædopsamlinger
Afprøvningen omfattede sæd fra 568 sædopsamlinger fra 228 Yorkshire orner fra seks forskellige KS-stationer. Fra 193 af ornerne blev anvendt sæd i avls- eller opformeringsbesætninger, hvorfra frugtbarhedsdata blev udtrukket til analyse. Ornerne var godkendte KS-orner [1] og blev sædopsamlet 1-2 gange ugentligt.
Fra hver af sædopsamlingerne blev der udtaget en sæddose til analyse. Sæddosen blev efter produktionen nedkølet til 17 grader og holdt ved 17 grader indtil analyse af sædens bevægelighed. Sædcellernes bevægelse blev analyseret med SpermVision på 3. dagen efter sædopsamlingen [3]. Sæden fra de resterende doser blev anvendt i avls- of opformeringsbesætninger i Danmark. Frugtbarhedsdata fra løbninger foretaget med de resterende sæddoser blev registreret i DanAvls avlsdatabase, hvorfra registreringer om faring og kuldstørrelse blev udtrukket.
Søer i afprøvningen
Der blev gennemført løbninger i avls- eller opformeringsbesætninger med sæd fra 382 af sædopsamlingerne fordelt på 193 orner. Løbningerne blev gennemført på både Landrace og Yorkshire søer, hvor cirka 31 procent var 1. kulds søer. Samlet blev gennemført 2.020 løbninger i avls- og opformeringsbesætninger. Løbningerne blev gennemført fra 0 til 6 dage efter produktion af sæddoserne, hvor 97 pct. af løbningerne var gennemført senest på 3. dagen efter produktion af sæddoserne. Løbningerne resulterede i 1.595 kuld.
Til analyse af sammenhæng mellem en enkelt måling af sæd fra en orne til samtlige løbninger fra pågældende orne indgik alle 193 orner. Fra de 193 orner i afprøvningen er samlet gennemført 38.249 løbninger i DanAvls avl- og opformeringsbesætninger. Disse har resulteret i 29.653 faringer.
Analyse for bevægeligheden af sædcellerne
Sæden i sæddosen blev opblandet grundigt ved at vende dosen 10 gange. Herefter blev 10 ml sæd overført til 10 ml NUNC-rør, hvorefter NUNC-røret blev placeret i 38 grader varmt vandbad i 50 minutter til varmereaktivering af sæden. Efter varmereaktivering blev sæden blandet grundigt inden der blev udtaget 2,3 µl sæd som blev overført til 20 µm dybt Leja-4 tællekammer. Sædens bevægelighed blev analyseret i 15 forskellige punkter i tællekammeret [3]. Hver sædcelles bevægelse blev analyseret for bevægelseshastighed og bevægelsesmønster (tabel 1). Alle analyser blev gennemført som dobbeltbestemmelser.
Registrering af kuldstørrelse og faringsprocent
For hver sædopsamling blev registreret insemineringsdato og faringsdato for de sæddoser, der blev anvendt i avls- eller opformeringsbesætninger. Søer, der ikke havde faret fem måneder efter inseminering, blev registreret som manglende faring. For søer, der farede, blev registreret faringsdato, kuldstørrelse målt som totaltfødte grise pr. kuld (FGK).
Statistik
Alle statistiske analyser blev gennemført med anvendelse af med SAS version 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Der blev i analyser anvendt signifikansgrænse på 5 pct.
Statistisk analyse af sædens bevægelighed
Sædceller med AOC > 5 blev karakteriseret som bevægelige. For bevægelige sædceller blev der for hver analysere beregnet median variationen mellem sædcellerne. Variationen blev estimeret ved forskellen mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne henholdsvis benævnt ”R-” foran variablen (tabel 1 og figur 1).
Tabel 1. Definition af afhængige variable i den statistiske analyse
| Parametre analyseret for hver sædcelle | |
| AOC | Average Orientation Change angiver gennemsnitlig drejning af sædcellens hoved. |
| VCL | Velocity Curved Line angiver sædcellens direkte svømmehastighed i analysen (figur 1). VCL for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse. VCL angives i µm/sekund. |
| VAP | Velocity Average Path angiver sædcellens gennemsnitlige svømmehastighed som udglattet linie (figur 1). VAP for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse. VAP angives i µm/sekund |
| VSL | Velocity Straigh Line angiver hastigheden for sædcellens bevægelse fra startpunktet til slutpunktet i analysen (figur 1). VSL for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse. VSL angives i µm/sekund. |
| ALH | ”Amplitude of Latarad Head displacement” angiver den gennemsnitligt amplitude i sædcellehovedets bevægelse (VCL) i forhold til sædcellehovedets gennemsnitlige svømmeretning (VAP). ALH angives i µm. |
| BCF | Beat Cross Frequency angiver frekvensen af hvor mange gange pr. sekund sædcellen slår med hovedet. BCF angives som frekvens (Hz). |
| Afledte variable | |
| MOT (Andelen af bevægelige sædceller) |
Alle sædceller med AOC > 5 grader er bevægelige. Kun bevægelige sædceller er medtaget i analyser af sæd-cellernes hastighed og bevægelsesmønster. Andelen af bevægelige sædceller angives i procent. |
| R-VCL | Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne. R-VCL angives i µm/sekund. |
| R-VAP | Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne. R-VAP angives i µm/sekund. |
| R-VSL | Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne. R-VSL angives i µm/sekund. |
| R-ALH | Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne. R-ALH angives i µm. |
| R-BCF | Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne. R-BCF angives som frekvens (Hz) |
| LIN | Linearity angiver forholdet mellem VSL og VCL og udtrykker om sædcellen har en lige bevægelse eller svøm-mer i ring. LIN er et forholdstal uden benævnelse. |
| STR | Straightness angiver forholdet mellem VSL og VAP og udtrykker om sædcellen har en lige fremadrettet bevæ-gelse. STR er et forholdstal uden benævnelse. |
| WOB | Wobble angiver forholdet mellem VCL og VAP og angiver hvor meget sædcellen bevæger sig fra sin gennem-snitlige svømmeretning og er udtryk for hvor meget sædcellen svinger med hovedet mens den svømmer. WOB er et forholdstal uden benævnelse. |
Figur 1: Angivelse af parametrene VCL, VAP, VSL samt ALH
for analyserne af sædcellens bevægelse. (Billednr. 1960)
Forskelle i sædbevægelighed mellem sædopsamlinger fra samme orne
Forskelle i sædcellers bevægelighed mellem sædopsamlinger fra samme orne blev undersøgt for orner, der havde mindst tre sædopsamlinger i afprøvningen.
Fra disse orner blev de tre første sædopsamlinger anvendt i analysen.
Sammenhængen mellem sædopsamlinger fra samme orne blev analyseret med mixed model med backwards selection og resulterede i følgende model:
Yijk= μ + ui+ wj + eijk
Yijk er den afhængige variabel.
μ angiver det generelle gennemsnit for den afhængige variabel
ui (i = 1-101) angiver tilfældig variation fra ornen.
wj (j = 1 – 3) angiver tilfældig variation fra sædopsamlingen
eijk er residualvariationen (antages normalt fordelt).
Repeterbarheden for analyse af sædcellernes bevægelighed blev vurderet for de afhængige variable (MOT og R-VCL) som blev fundet havende statistisk sikker sammenhæng til kuldstørrelse eller faringsprocent. Repeterbarheden blev estimeret som 95 pct. konfidensinterval beregnet som 1,96 x spredningen estimeret ud fra residualvariationen.
Sammenhæng mellem sædcellers bevægelighed og frugtbarhed af sæden
Sammenhængen mellem sædcellers bevægelighed og sædens frugtbarhed blev analyseret for alle insemineringer foretaget med sæd, som blev undersøgt for sædbevægelighed. Statistisk model for sammenhæng mellem antal grise pr. kuld (FGK) og sædens bevægelsesparametre blev analyseret med mixed model med backwards selection og kan beskrives ved følgende model:
Yik= μ + Ai + B + C + wk + eik
Yik er den afhængige variabel.
μ angiver det generelle gennemsnit for kuldstørrelsen
Ai (i = 1-4) angiver soens kuld nr., hvor 4 er 4. kuld eller ældre
B angiver andelen af bevægelige sædceller (MOT)
C angiver R-VCL
wk angiver tilfældig variation mellem sædopsamlinger
eik er residualvariationen (antages normalt fordelt).
Sammenhængen mellem faringsprocent og sædens bevægelsesparametre blev analyseret ved anvendelse af logistisk regression med backwards selection og resulterede i følgende model:
ln(pij/(1-pij)) = μ + Ai +βBj + wj
p angiver sandsynligheden for faring
μ angiver det generelle gennemsnit for kuldstørrelsen
Ai (i = 1-2) angiver sædens alder hvor 1 er sæd der er anvendt på dag 0 eller 1; 2 er sæd som er anvendt dag 2 eller senere.
B angiver andelen af bevægelige sædceller (MOT).
wj angiver overspredning mellem løbninger med sæd fra samme sædopsamling, denne antages normal fordelt.
Sammenhæng mellem sædbevægelighed fra en enkelt sædopsamling til ornens gennemsnitlige frugtbarhed
I analysen blev inkluderet sædundersøgelse af første sædopsamling i afprøvningen. Alle insemineringer foretaget med sæd fra orner i afprøvningen blev inkluderet. Sammenhængen mellem sædcellernes bevægelsesparametre og kuldstørrelsen blev analyseret med mixed model med backwards selection og resulterede i følgende model:
Yijfk= μ + Ai + Bj + Cf + D + E + wk + eik
Yijfk er den afhængige variabel.
μ angiver det generelle gennemsnit for kuldstørrelsen.
Ai (i = 1 - 4) angiver soens kuld nr., hvor 4 er 4. kuld eller ældre.
Bj (j = 1,2) angiver sædens alder, hvor 2 er sæd der er 2 dage gammel eller ældre.
Cf angiver soens race (Landrace eller Yorkshire).
D angiver andelen af bevægelige sædceller (MOT).
E angiver R-VCL
wk angiver tilfældig variation mellem sædopsamlinger fra samme orne
eijfk er residualvariationen (antages normalt fordelt).
Analyse af sammenhæng mellem faringsprocent og sædens bevægelsesparametre blev analyseret med logistisk regression med backwards selection og resulterede i følgende model:
ln(pijk/(1-pijk)) = μ + Ai + Bj + C*β
p angiver sandsynligheden for faring
μ angiver det generelle gennemsnit for kuldstørrelsen
Ai (i = 1-2) angiver sædens alder hvor 1 er sæd der er anvendt på dag 0 eller 1; 2 er sæd som er anvendt dag 2 eller senere.
Bj (j=1-4) angiver soens alder i kuld, hvor 4 angiver 4. kuld eller ældre.
C angiver ornens alder relativt fra indsættelse på KS-station, hvor dato for 1. sædopsamling angives som 0.
Resultater og diskussion
Forskelle i sædbevægelighed mellem sædopsamlinger fra samme orne
Forskellene mellem sædopsamlinger fra samme orne blev analyseret som variansen mellem tre forskellige sædopsamlinger sat i forhold til variansen mellem orner. Analyserne omfattede målinger af sædopsamlinger fra 101 orner. Resultaterne viste, at for R-VCL samt andelen af bevægelige sædceller var forskellene mellem sædopsamlingerne cirka halvdelen af forskellene mellem orner (tabel 2). Konfidensintervallet for en analyse var cirka fem for måling af sædens motilitet, hvilket indikerer, at målingerne har været udført korrekt, da dette stemmer overens med tidligere undersøgelser [3]. Konfidensintervallet for en analyse skal kan betragtes som analysens repeterbarhed.
Tabel 2. Oversigt over variansen for orne og sædopsamling for målinger af andelen af bevægelige sædceller (MOT), sædcellernes svømmehastighed (VCL) samt variationen for målingen af sædcellernes svømmehastighed (R-VCL).
| Variabel | MOT | R-VCL |
|---|---|---|
| Varians mellem orner | 151 | 192 |
| Varians mellem sædopsamlinger | 84,8 | 102 |
| Residualvarians (tilfældig mellem målinger) | 6,8 | 28,6 |
| Estimat for gennemsnit for målingerne | 66,4 pct. | 76,7 µm/sekund |
| 95 Konfidensinterval for en analyse | ± 5,1 | ± 10,5 |
Repeterbarheden viste større spredning ved analyse af R-VCL end for MOT. Repeterbarheden har betydning for, hvor sikker man kan være på et resultat. Selv om alle parametrene er udledt fra samme analyse af sæden, findes der tilsyneladende forskelle i repeterbarheden for de forskellige parametre. Repeterbarheden vil formentlig kunne forbedres, hvis der kunne analyseres flere celler. En årsag til den lavere repeterbarhed af R-VCL kan skyldes, at R-VCL blev udregnet på baggrund af en del af de bevægelige sædceller. Herved indgik færre celler i beregningerne af estimatet for R-VCL.
Sammenhæng mellem sædcellers bevægelighed og frugtbarhed af sæden
Resultaterne viste sammenhæng mellem kuldstørrelsen og MOT samt R-VCL. Ved fald i MOT på 10 procentenheder sås gennemsnitlig fald i kuldstørrelsen på 0,37 grise pr. kuld og ved stigning i R-VCL på 10 sås et fald på 0,17 grise pr. kuld (fordelingen af data for MOT og R-VCL kan ses i figur 2).
Resultaterne viste også eksempler på høj kuldstørrelse, selv om bevægeligheden af sædcellerne var ringe eller R-VCL var høj. Det er bemærkelsesværdigt, at prøver med en meget lav andel af bevægelige sædceller kan resultere i normal kuldstørrelse, da andelen af bevægelige sædceller til dels kan opfattes som om, at sædcellerne er levende. Det kan dog ikke udelukkes, at den undersøgte sædportion har været udsat for en påvirkning, der har haft negativ indvirkning på bevægeligheden af sædceller og derved påvirket resultatet af målingen.
Analyserne af faringsprocent viste statistisk sikker effekt af andelen af bevægelige sædceller (figur 3). Ved fald i andelen af bevægelige sædceller med 10 procentenheder reduceredes faringsprocenten cirka 7 procentenheder. Sammenhængen var ikke lineær og betydningen af andelen af bevægelige sædceller var større ved lav andel af bevægelige sædceller.
Figur 3. Oversigt over sammenhæng mellem faringsprocent og måling af sædcellernes bevægelighed (MOT). Linierne repræsenterer den estimerede tendenslinie for sæd anvendt på 1. dagen efter sædopsamling (sort linie) eller senere (rød linie)
Sammenhæng mellem sædbevægelighed fra en enkelt sædopsamling til ornens gennemsnitlige frugtbarhed
Resultaterne viste statistisk sikker sammenhæng mellem kuldstørrelsen og andelen af bevægelige sædceller (MOT) og variationen for sædcellernes svømmehastighed (R-VCL). Ved en fald i MOT på 10 procentenheder sås en gennemsnitlig reduktion i kuldstørrelsen på 0,25 grise pr. kuld. Ved stigning i 10 i R-VCL sås en gennemsnitlig fald på 0,15 grise pr. kuld.
Der var derimod ikke statistisk sikker sammenhæng mellem nogle af måleparametrene og gennemsnitlig faringsprocent for kuldene fra hver af ornerne. Årsagen til manglende sammenhæng skal formentlig ses på baggrund af, at der findes for store forskelle i ornens sædkvalitet samt soens reproduktion over året. For hver af ornerne er samtlige af sædopsamlingerne gennemført inden for cirka 1-2 måneder og er dermed et øjebliksbillede. Det vides, at der findes årstidsvariationer for sædens kvalitet [4], [5], [6] hvorfor sammenhængen mellem forskellige sædopsamlinger med større tidsinterval kan forventes at være større. Dette, sammenholdt med at variationen for faringsprocenten var større end for kuldstørrelsen, bevirkede, at sammenhængende ikke blev fundet statistisk sikre.
Udenlandske undersøgelser har vist sammenhæng mellem frugtbarheden og sædcellernes bevægelseshastighed fra startpunkt til slutunkt i analysen (VSL) [7], denne effekt kan delvis bekræftes i dette studie, da variablene VSL, MOT og R-VCL alle er korrelerede. En hollandsk undersøgelse har ligeledes fundet sammenhæng mellem parametre for sædens bevægelighed og sædens frugtbarhed. Her blev fundet væsentlig ringere repeterbarhed, idet denne var cirka 10 med cirka fem i denne undersøgelse [8]. Dog blev anvendt et andet instrument til måling af sædens bevægelighed, sæden blev analyseret umiddelbart efter sædopsamling og målingerne omfatter analyser foretaget på flere forskellige laboratorier og af flere forskellige personer end i denne undersøgelse. Dette kan være medvirkende til, at repeterbarheden var lavere i denne undersøgelse.
Denne undersøgelse omfattede analyser af sæd fra Yorkshire orner. Yorkshire er den race, hvor sæden og ornen har størst indflydelse på kuldresultatet [2]. Det kan forventes, at sammenhængen mellem parametrene for sædens bevægelighed og frugtbarheden også findes for sæd fra Landrace, men at effekten forventes at være mindre end for Yorkshire.
Konklusion
Der blev fundet statistisk sikker sammenhæng mellem nogle af sædens bevægelsesparametre og sædens frugtbarhed. Ved fald i andelen af bevægelige sædceller på 10 procentenheder sås fald på 0,37 grise. Ved stigning i R-VCL (variation for bevægelseshastighed af sædcellerne) sås fald i kuldstørrelsen på 0,17 grise. Disse effekter er additive.
Der blev tillige fundet sammenhæng mellem en enkelt måling af sædens bevægelighed fra en orne til alle gennemsnitlige kuldstørrelse fra kuld opnået med sæd fra pågældende orne. Effekten var mindre end ved en måling af den samme sæd, som blev anvendt til løbning. Ved fald i andelen af bevægelige sædceller på 10 procentenheder sås fald i kuldstørrelsen på 0,25. Ved stigning i R-VCL på 10 procentenheder sås fald i kuldstørrelsen på 0,15 grise pr. kuld.
Der blev tillige fundet statistisk sikker sammenhæng mellem faringsprocenten og sædens bevægelsesparametre. Således blev fundet, at fald i andelen af bevægelige sædceller på 10 procentenheder bevirkede et fald i faringsprocenten på cirka 7 procentenheder. Der blev ikke fundet statistisk sikker sammenhæng mellem en enkelt måling af sæd fra en orne til faringsprocenten opnået med alle sædopsamlinger fra pågældende orne.
Referencer
Afprøvningen blev delvist finansieret af DanAvls KS-stationer.
Deltagere
Statistiker Mai Britt Friis Nielsen, Landbrug & Fødevarer - Svineproduktion
Laboratoriemedarbejdere hos Hatting-KS og Ornestation Mors.
Afprøvning: 975