Koncentrationsbestemmelse i ornesæd målt med fotometer og ved tælling i hæmacytometer

Koncentrationsbestemmelsen af ornesæd på de danske KS-stationer udføres ved hjælp af et fotometer. Metoden udføres ved at gennemlyse en fortyndet sædprøve med lys af en bestemt bølgelængde (540 nm). Mængden af tilbageholdt lys (ekstinktionsværdien) hænger sammen med sædens koncentration. Metoden kaldes også lysabsorptionsmetoden.

Sammenhængen mellem ekstinktionsværdi og spermiekoncentration kan omsættes til en standardkurve, der kan bruges ved spermiekoncentrationsbestemmelsen og efterfølgende fortynding af sæden.

Den hidtil anvendte standardkurve bygger på resultater primært målt på Landrace og Yorkshire.

Standardkurven kan ændre udseende som følge af ændringer i ornepopulationens sammensætning samt det anvendte fotometerfabrikat. Det er på denne baggrund, at nærværende undersøgelse blev gennemført.

Formål

Det er undersøgelsens formål at fastlægge en ny standardkurve til spermiekoncentrationsmåling med baggrund i den aktuelle målemetode.

Den nye standardkurve sammenholdes med den hidtil anvendte, og det undersøges, hvorvidt de enkelte orneracer har indflydelse på standardkurvens forløb.

Til undersøgelsen blev indsamlet 114 prøver fra 38 orner fordelt på racerne Yorkshire, Hampshire, Duroc og Landrace. Ornerne blev tilfældigt udvalgt blandt de opstaldede orner på KS-stationen Hatting-Ringsted, og de indgik alle i en normal sædopsamlingsrutine.

Inden sæden blev præpareret i laboratoriet, blev der fra hvert ejakulat udtaget 3 separate prøver.

Sædprøverne blev straks fortyndet 40 gange med EDTA-fortynder og blandet grundigt hvorefter ekstinktionsværdien blev målt ved 540 nm i et fotometer. Fra den fortyndede sæd i fotometercuvetten blev der udtaget en prøve til koncentrationsbestemmelse i et Thoma hæmacytometer (direkte tælling). Et Thoma hæmocytometer er et tællekammer med et kendt rumfang, hvor man ved 200 ganges forstørrelse kan tælle antallet af sædceller pr. rumfangsenhed.

Resultaterne lå alle på nær to indenfor ekstinktionsintervallet 0,15 - 0,45. Måleresultaterne blev sammenlignet med regressionsanalyse efter GLM-proceduren (SAS-INST.INC.)

Et efterfølgende forsøg på at indsamle måleresultater med hhv. ekstinktionsværdi over 0,45 og under 0,15 blandt 75 ejekulater fra orner opstaldede på Hatting Ringsted og Hatting Horsens var ikke mulig, hvorfor undersøgelsen blev begrænset til at gælde for ekstinktionsintervallet 0,15 - 0,45. De to målinger, der lå udenfor dette interval, blev ikke medtaget i undersøgelsen. Den statistiske analyse viser, at der er en signifikant sammenhæng mellem de målte ekstinktionsværdier og spermiekoncentrationen i de enkelte ejakulater.

Figur 1.	STANDARDKURVE: Til fotometrisk koncentrationsbestemmelse af ornesæd

Sammenhængen mellem koncentrationsmåling ved direkte tælling og lysabsorptionsmetoden beskrives af følgende ligning. Resultaterne er angivet i figur 1.

Y = e^{(2,40 + 4,58 X)} × 10.000

Som udtryk for metodens sikkerhed er den nedre 68 pct. variationsgrænse indtegnet. Endvidere er den hidtil anvendte kurve til fortynding indtegnet (EKSIST. kurve). En variationsgrænse på 68 pct. betyder, at i 84 pct. af tilfældene, over en periode, vil den faktiske koncentration ved en koncentrationsbestemmelse ligge over den målte koncentration.

Den gennemsnitlige ekstinktionsværdi i forsøget er 0,26. Dette svarer til en gennemsnitlig koncentration på 362.500 sædceller pr. kubik mm. Spredningen (s) ved denne koncentration er 72.500 svarende til 20 pct. Den faktiske koncentration ved en ekstinktionsværdi på 0,26 vil derfor i 68 pct. af tilfældene (1 x s) ligge mellem 290.000 og 453.000 sædceller pr. kubik mm³.

Den nye standardkurves gennemsnit afviger indenfor arbejdsområdet 0,15 - 0,45 fra den nuværende standardkurve med følgende tal i tabel 1.

Tabel 1. Sammenligning af "NY" og "EKSESTERENDE" standardkurve
Ekstv.	"EKSIST" kurve spermier/kubik mm	"NY" kurve	Afvigelse i forhold til "EKSIST" kurve
0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,375 0,40 0,45	230.000 290.000 400.000 460.000 520.000 565.000 580.000 625.000	220.000 275.000 345.000 435.000 550.000 615.000 690.000 865.000	- 4 pct. - 5 pct. - 13 pct. - 5 pct. + 6 pct. + 9 pct. + 16 pct. + 38 pct.

Testen har vist, at orneracen ingen indflydelse har på koncentrationsmålingen ved lysabsorption. Spredningen på ekstinktionsværdierne er ligeledes uafhængige af spermiekoncentrationen i ejakulaterne.

Undersøgelsen viser, at der er god sammenhæng mellem sædens ekstinktionsværdi målt ved 540 nm og antallet af spermier pr. volumenenhed sæd.

En sammenligning af den eksisterende standardkurves gennemsnit med den nye standardkurves gennemsnit viser, at sædens koncentration bliver overvurderet efter den eksisterende standardkurve i ekstinktionsintervallet 0,15 - 0,30 og undervurderet i intervallet 0,30 - 0,45. Den gennemsnitlige ekstinktionsværdi i undersøgelsen er 0,26. Ved denne værdi er afvigelsen ca. 13 pct. mellem de to kurver.

Tabel 2 er en oversigt over gennemsnitlige ekstinktionsværdier for året 1988 fra Hatting horsens fordelt på racerne Duroc, Yorkshire, Hampshire og Landrace. Der er korrigeret for tidsperiode mellem hver opsamling.

Tabel 2. Orneracernes gennemsnitlige ekstinktionsværdi for perioden 01.01.88-01.12.88 på Hatting Horsens
Race	Ekstinktionsværdi	Antal Spring
Duroc Yorkshire Hampshire Landrace Hamps. x Duroc	0,32 0,27 0,19 0,27 0,28	2.696 2.359 879 1.157 431

Koncentrationen i ornesæd bestemt efter den eksisterende standardkurve overvurderes i forhold til den nye standardkurve. Det bør overvejes at indføre den nye standardkurve på KS-stationernes laboratorium, idet denne mere præcist beskriver den aktuelle sammenhæng mellem spermiekoncentrationen og ekstinktionsværdien målt med fotometer. Kurven i figur 1 er i appendix omregnet med angivelse af det nødvendige ml. råsæd til en insemineringsdosis indeholdende ca. 2,0 mia spermier.

Ved benyttelse af den nye standardkurve vil en sæddosis med deklareret indhold på 2,0 mia. motile sædceller (90 pct. motilitet), fremstillet af ornesæd med en ekstinktionsværdi på 0,26, i 68 pct. af tilfældene indeholde fra 1,8 mia - 2,8 mia motile sædceller (90 pct. motilitet). Metoden påvirkes ikke af orneracen, hvorfor samme standardkurve kan anvendes til samtlige racer. En formodning om, at metodens sikkerhed var afhængig af spermiekoncentrationen i ejakulatet, således at specielt tynde ejakulats koncentration blev bestemt med størst usikkerhed, kan afkræftes med denne undersøgelse.

Nye metoder bør undersøges med henblik på at minimere den store spredning i måleresultaterne, således at koncentrationsbestemmelsen kan ske mere præcist. Sådanne metoder vil føre til en bedre udnyttelse af ornerne.

SAS/STAT GUIDE, Version 6 edition, kapital 20, SAS INSTITUTE Inc., U.S.A. 1987.

Antal ml råsæd til ca. 2,0 mia. motile spermier pr. dosis.

Skalaværdi (Ekstinktionsværdi)	Sædceller pr. kubik mm	Ml. råsæd pr. dosis ved motilitet
		90 pct.	80 pct.	70 pct.
0,15 0,16 0,17 0,18 0,19 0,20 0,21 0,22 0,23 0,24 0,25 0,26 0,27 0,28 0,29 0,30 0,31 0,32 0,33 0,34 0,35 0,36 0,37 0,38 0,39 0,40 0,41 0,42 0,43 0,44 0,45	220.000 230.000 240.000 250.000 265.000 275.000 290.000 300.000 315.000 330.000 345.000 360.000 380.000 400.000 415.000 435.000 455.000 475.000 500.000 525.000 550.000 575.000 600.000 630.000 660.000 690.000 720.000 755.000 790.000 825.000 865.000	10 9,7 9,3 8,9 8,4 8,1 7,7 7,4 7,1 6,7 6,4 6,2 5,8 5,6 5,4 5,1 4,9 4,7 4,4 4,2 4,0 3,9 3,7 3,5 3,4 3,2 3,1 2,9 2,8 2,7 2,6	11 11 10 10 9,4 9,1 8,6 8,3 8,0 7,6 7,2 6,9 6,6 6,3 6,0 5,7 5,5 5,3 5,0 4,8 4,5 4,3 4,2 4,0 3,8 3,6 3,5 3,3 3,2 3,0 2,9	13 12 12 11 11 10 10 9,5 9,1 8,7 8,3 7,9 7,5 7,1 6,9 6,6 6,3 6,0 5,7 5,4 5,1 5,0 4,8 4,5 4,3 4,1 4,0 3,8 3,6 3,5 3,3
Tabellen gælder kun for ekstinktionsværdiintervallet 0,15 - 0,45. Fotometer: Corning 252 colorimeter med 540 nm filter. Fortynding: 1/2 ml. råsæd i 19,5 ml EDTA-fortynder (40 x fortynding).