Koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved fotometri

SAMMENDRAG

Der er blevet udarbejdet en ny standardkurve til DS-fotometret, Cor­ning 252, til anvendel­se ved koncentrationsbe­stemmelse af ornesæd. Standardkurven blev udarbej­det på bag­grund af fortyndingsrækkeforsøg samt samtidige foto­metermålinger og koncentra­tions­be­stemmel­ser ved tællinger.

To nye typer af fotometre: Shimadzu 1201 og Spectronic 301 blev undersøgt med henblik på fotometrenes egnethed til koncentrationsbestemmelse af ornesæd. Ved koncentrations­be­stem­melse med begge de nævnte fotometre var spredningen på be­stemmelserne lidt større end ved kon­centrationsbestemmelse med Cor­ning 252.

Det kan på baggrund af denne undersøgelse ikke anbefales at udskifte fotometre af typen Corning 252 med Shimadzu 1201 eller Spectronic 301.

Den såkaldte DEFT-analysemetode kan ikke umiddelbart anvendes til koncentrations­be­stemmelse af ornesæd.

BAGGRUND

De danske KS-stationer anvender foto­metre af typen Corning 252 til koncentra­tionsbe­stemmelse af orne­sæd.

KS-stationernes fotometre justeres jævnligt ved sam­menligning mellem stationsfoto­me­trene og et referen­cefotometer (DS-fotome­ter). Stan­dard­kurven til DS-foto­metret blev udarbejdet i 1990. I januar 1991 blev re­ferencefotometrets standard­kurve kontrol­leret. Kon­trollen viste, at referen­cefoto­metrets standardkurve til­syneladende havde rykket sig.

Corning 252 er et ældre fotometer og der er udviklet nye fotometre med andre og bedre tekniske specifika­tioner: Digitaliseret aflæs­ning; måleværdien er et gennemsnit af flere målinger foretaget hurtigt (msek.) efter hinanden; afstanden fra prøven til detektoren er mindre; båndbredden er snævrere d.v.s. at der er mindre variation i bølgelæng­den af lyset etc. Alle disse tekniske forbedringer forventes at give en min­dre spredning på koncentrationsbe­stemmel­sen.

Indenfor levnedsmiddelindustrien er der udviklet et analyseudstyr - DEFT-analy­seud­styr - til "koncentra­tionsbestem­melse" af bakterier, specielt i vandprøver. Meto­den er dog for kompliceret og tids­kræven­de til an­vendelse ved koncentrationsbe­stemmelse af ornesæd på en KS-station. Hvis metoden udviser minimal spredning på kon­centrations­bestemmelse af ornesæd, kan metoden derimod bruges til hyppi­gere kontrol af såvel referen­ce-fotometer som stations­foto­metre.

Formålet med undersøgelsen var at ud­arbejde en ny standardkurve for referen­cefoto­metret, at vurdere to nye typer af foto­metre samt DEFT-metodens egnethed til kon­centrations­bes­temmel­se af ornesæd.

MATERIALE OG METODE

Undersøgelsen blev gennemført på Hatting Viborg, DS-laboratoriet i Kjellerup og Miljø- og Levneds­mid­delcentret i Horsens.

Igennem fem dage blev der udtaget 10 sæd­prøver pr. dag d.v.s. ialt 50 prøver. Prøver­ne blev udtaget således at såvel alle racer som et bredt udsnit af koncentratio­ner (foto­metervær­dier fra 0,13-0,68) re­præsentere­des.

Der blev fra hver opsamling udtaget to prø­ver til måling af tæthed i Corning 252, Spec­tronic 301 og Shimadzu 1201. Hver prøve bestod af 0,5 ml råsæd og 19,5 ml EDTA-for­tynder.

Efter aflæsning af fotometerværdierne sam­menblandedes de to prøver fra samme ejaku­lat. Prøverne blev herefter kørt til laboratori­et i Kjellerup til koncentra­tions­bestemmelse ved tælling. Det var altså nøjagtig de samme prøver, der blev kon­centrationsbe­stemt ved tælling som ved fotometer-måling.

Tællingerne blev udført som dobbelt-be­stem­mel­se. Koncentrationsbestemmelse ved tæl­ling blev fore­taget ved at fylde et specielt tællekammer med den fortyndede sædopløs­ning. Derefter blev tællekam­meret anbragt i mikroskop og ved 200 ganges forstørrelse taltes antallet af sæd­celler i et givent rumfang (0,02 kubik mm). På baggrund af antal sædceller, fortyndings­grad og rumfang blev koncentra­tio­nen i råsæden beregnet.

Fra hvert ejakulat blev der desuden frem­stillet to fortyndinger- såkaldte forlag; for­tyndingsfor­holdet afhang af den allerede aflæste fotometerværdi. Forlagene frem­stille­des umiddelbart efter opsamling for samtlige de ejakulater, der ønskedes un­der­søgt den pågældende dag, idet der ved hurtig fortyn­ding opnås en mere homo­gen blanding.

Ud fra hvert forlag fremstilledes en for­tyn­dingsrække med følgende fortyndings­forhold:

 1 ml forlag og 9 ml fortynder

 3 ml forlag og 7 ml fortynder

 5 ml forlag og 5 ml fortynder

 8 ml forlag og 2 ml fortynder

10 ml forlag

Fortyndinsforholdene blev valgt ud fra en antagelse om en lineær sammenhæng d.v.s. at kon­centrationen forventedes at være tre gange så stor, når der blev brugt tre gange så meget forlag. Fortyndingsfor­holdene valgtes desuden for at foto­me­terudslagene skulle ligge i intervallet 0,15 -0,50 (Corning 252), hvor aflæs­ningen kan fore­tages med den største sikkerhed.

Straks efter fortynding blev tætheden i for­tyndingerne målt med de tre for­skellige fotometre: Corning 252, Spectronic 301 og Shimadzu 1201. Der anvendtes runde optiske genbrugs-cuvetter til Corning og firkantede engangs-cuvetter til Spectronic og Shi­madzu.

Ti råsædsprøver á ca. 10 ml sendtes til Mil­jø- og Levnedsmiddelcentret i Horsens; prøver­ne anvendtes til kon­centrationsbe­stem­melse ved hjælp af DEFT-analyse-udstyret.

RESULTATER OG DISKUSSION

Analyserne viste, at der var en sammen­hæng mellem koncentrationen (bestemt ved tælling) og fotometerudslaget. Ved trans­formation af værdierne med den naturlige logaritme blev der opnået en lineær sam­menhæng.

Sammenhængen kan beskrives ved form­len:

              Koncentrationen = a * (fotometer­værdi)EXP ^b

hvor a og b er parametre, der angiver hen­holdsvis skæring og hældning for den rette linie. Hældningen bestemmes bedst ud fra for­tyn­dingsrækkerne, og a estimeres dernæst udfra sammenhørende bestemmelser af fotometer­værdien og kon­centrationen bestemt ved tælling.

Den gennemsnitlige fotometerværdi i for­søget var for Corning 252 = 0,31 (dobbelt­bestemmel­se). Dette svarer til en koncentra­tion på 325.000 sædceller pr. kubik mm. Der er en spredning (s) ved denne koncentration på 39.000 sædceller pr. kubik mm.

Den gennemsnitlige fotometerværdi i for­søget var for Shimadzu 1201 = 0,4843 (dobbeltbestem­melse). Dette svarer til en koncentration på 325.000 sædceller pr. kubik mm. Spredningen (s) ved denne koncentration er 45.000 sædceller pr. kubik mm.

Den gennemsnitlige fotometerværdi i for­søget var for Spectronic 301 = 0,4739 (dob­beltbe­stem­melse). Dette svarer til en kon­centration på 325.000 sædceller pr. kubik mm. Spredningen (s) ved denne koncentration er 44.000 sædceller pr. kubik mm.

En sammenligning af de tre fotometre viste, at Corning 252 var mindst lige så velegnet til koncentrationsbestemmelse af ornesæd som Shimadzu 1201 og Spec­tronic 301, idet spredningen på den fotometerbestemte kon­centration var mindre med Corning 252 end med de andre fotometre.

Forventningerne om lavere spredning på målinger foretaget med de nye typer foto­metre - på grund af de bedre tekniske speci­fikationer - blev altså ikke opfyldt.

Med hensyn til DEFT-analyse-metoden, blev det fra Miljø- og Levnedsmiddelcentret i Horsens oplyst, at det var vanskeligt at fil­trere prøverne (filtreringen er nødvendig med henblik på tælling ved DEFT-metoden). Spredningen på målinger indenfor samme prøve var 23 pct.

Usikkerheden på koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved lysabsorption (nævnte foto­metre) er forholdsvis stor; i 95 pct. af til­fældene vil den faktiske koncentration i en given prøve således ligge indenfor standard­kurve-koncentratio­nen ±24 pct. (Corning 252).

Det kan, på baggrund af denne undersøgelse, ikke anbefales at udskifte de nuværende KS-stationsfotometre af typen Corning 252 med Shimadzu 1201 eller Spectronic 301, idet usikkerheden på koncentrationsbestemmelse af ornesæd med Shimadzu 1201 og Spec­tronic 301 var mindst lige så stor som med Corning 252.