Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstempera­tur på motiliteten i ornesæd

SAMMENDRAG

Effekten af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motili­teten i færdig­for­tyndet ornesæd blev under­søgt ved sammenligning af moti­liteten i sæd, opbe­varet ved to forskel­lige tem­peraturer, henholdsvis 16 og 22 grader celcius, og fortyndet efter tre forskellige fortyndingsproce­durer.

I undersøgelsen, der blev gennemført på Hatting Ringsted, indgik 76 sædopsam­linger fra 62 orner.

Opbevaringstemperaturen (16 grader celcius eller 22 grader celcius) havde ingen effekt på moti­liteten i den færdigfortyndede sæd.

Fortyndingsproceduren havde 48 timer efter opsamling ikke statistisk sikker effekt på motiliteten. Derimod var der en effekt af fortyndingsproceduren såvel 72 som 96 timer efter opsam­ling. Den for­tyndingsprocedure, hvor et cirka 30 grader celcius varmt forlag blev færdigfortyndet med 20 grader celcius varm fortyn­der, havde det laveste fald i motilitet. Det vil sige, at 72 og 96 timer efter opsamling havde sæd fortyndet på denne måde den bed­ste motili­tet.

Trods den statistiske sikkerhed i motilitetsfald var der tale om små forskelle, som kun medførte en begrænset reduktion i antallet af levende sæd­celler i insemina­tionsdosen. Da det var et labora­torieforsøg, hvor kun motiliteten blev an­vendt som måleparameter, kan det ikke umiddelbart for­svares at ændre på den nuværen­de fortyndingsprocedure på KS-stationerne. Før en eventuel ændring af procedure kan komme på tale, skal der udføres insemineringsforsøg, hvor reproduk­tionsresultaterne med sæd fortyndet efter forskellige pro­cedurer op­gøres og sammenlignes.

BAGGRUND

Både sædcellers motilitet (fremadbevægelse) og integritet (uden beskadigelser) angives at være af­hængig af bl.a. nedkølingsmetode og opbevaring­stemperatur.

Motiliteten er betinget af, at sædcellerne er i be­siddelse af energi. Da sædceller­nes ener­gireser­ver/ev­ne til at gendanne energi er be­grænsede, skal det ved opbe­varing af sæden tilstræbes, at sædceller­nes energiforbrug er så lavt som muligt. Sædceller i bevægelse for­bruger mere energi end ubevægelige sædceller. Bevægel­sesintensiteten falder med faldende temperatur.

Den nedre temperaturgrænse for opbevaring af ornesædceller er cirka 15 grader celcius. Udsættes ornesædceller for lavere temperaturer ses irrever­sible beskadigelser, det vil sige, at beskadigelserne trods stigende tempera­tur ikke udbedres igen.

I en forundersøgelse af forskellige nedkø­lingsmetoders og opbe­va­ringstemperaturers indflydelse på sæd­cellernes motilitet og integ­ritet var der en tendens til, at motiliteten faldt langsomst ved en konstant, lav opbe­varingstem­peratur (20 grader celcius). Der blev ikke påvist forskelle i integritet.

Formålet var derfor på et større materiale at under­søge, om en hurtig nedkøling og efterfølgende opbe­varing af sæden ved konstante, lave temperaturer havde en effekt på sædcellernes motilitet. Proce­durerne for forar­bejdning skulle herigennem optimeres for derved at begræn­se fal­det i motilitet ved opbe­varing af den færdig­fortynde­de sæd.

MATERIALE OG METODE

Undersøgelsen, der blev gennemført på Hatting Ringsted, omfattede 76 sædopsam­linger (fire pr. dag) fra 62 for­skellige orner.

Stationens sædvanlige arbejdsprocedure blev fulgt indtil forlaget var færdigt, det vil sige, sæden var forfortyndet således, at 25 ml forlag inde­holdt 2 milliarder motile sædcel­ler. Temperaturen i forlaget var cirka 30 grader celcius.

Forlaget blev delt i tre:

Fortyn­dingspro­cedure 1:

Færdigfor­tynding med 30 grader celcius varm for­tyn­der (nuværen­de meto­de).

Fortyn­dingspro­cedure 2:

Færdigfor­tynding med 20 grader celcius varm fortynder.

Fortyn­dingspro­cedure 3:

Køling på vandbad til 20 grader celcius før fær­digfortyn­ding med 20 grader celcius varm fortynder.

Hver sæddose var på cirka 85 ml og inde­holdt 2 mia. levende, fremadbevægelige sædceller.

En dose fra hver fortynding blev opbevaret konstant ved 22 grader celcius og én konstant ved 16 grader celcius, det vil sige, at der for hver opsamling var tre doser ved 22 grader celcius og tre doser ved 16 grader celcius. Alle doser til opbevaring ved 22 grader celcius fra samme dag blev pakket i en styroporbox. Med fire op­samlinger pr. dag og tre doser pr. opsam­ling indeholdt hver styroporbox 12 doser; tilsvarende for doser til opbevaring ved 16 grader celcius.

Temperaturen i thermoskabene blev kontrol­leret ved hjælp af en Grant datalogger. Ved hjælp af følere placeret i begge thermoskabe blev temperaturen i skabene registreret samti­digt med et givet tids­inter­val. Der blev fore­taget kontrolmålinger af temperaturerne i to perioder med henholdsvis seks og fire timers intervaller.

Motiliteten blev vurderet for hver opbe­varingstemperatur og fortynding­sprocedure henholdsvis 48, 72 og 96 timer efter opsam­ling. Motilitetsvur­deringen blev foretaget efter reakti­vering af sæddoserne, det vil sige, at doserne blev anbragt i vandbad ved 35 grader celcius i 30 minutter før vurdering.

Vurderingerne blev foretaget i fasekontrast­mikroskop ved 200 ganges forstørrelse. Der var tale om subjektive vurderinger, hvor samme per­son foretog alle vurderingerne. Motilitets-vurderingerne blev foretaget efter en skala fra 0 til 90 med interval­ler på 10 (samme skala som rutine­mæssigt anvendes på KS-stationerne). Kun sæd med god fremad­bevægelse og få defekte sædceller blev vur­deret til "motilitet 90". Sæd med dårligere bevægelse og/eller flere defekte sædceller blev vurderet til "motilitet 80", "motilitet 70" eller eventuelt lavere.

RESULTATER OG DISKUSSION

Alle analyser blev foretaget på motilitet­sfor­skelle beregnet som ud­gangsmotiliteten (tid=0) minus motiliteten vurderet henholds­vis 48, 72 og 96 timer efter opsamling. Herved udelukkes effekten af forskelle i sædkvalite­ten i de opsamlin­ger, som indgik i under­søgelsen. I denne undersøgelse var der ikke vek­selvirkninger mellem fortyn­dingsproce­dure og opbevaringstemperatur.

Fortyndingsproceduren havde 48 timer efter opsamling ikke sta­tistisk sikker indflydelse på motilitetsfaldet. Derimod var motilitets­faldet efter 72 timer sta­tistisk sikkert la­vere ved fortyndingspro­cedure 2 end ved pro­cedure 1 (­p=.002) og proce­dure 3 (p=.006). Tilsvarende påvistes motilitets­faldet efter 96 timer at være sta­tist­isk sikkert lavere ved procedure 2 end ved procedure 1 (p=.001) og procedure 3 (p=.005). Såvel 72 som 96 timer efter opsamling var motiliteten i den sæd, der var fortyndet efter pro­cedure 2, altså bedre end motiliteten i den sæd, der var fortyndet efter procedure 1 eller procedure 3.

* Hvert gennemsnit er beregnet på baggrund af 152 vurderinger.

* Hvert gennemsnit er beregnet på baggrund af 228 vurderinger.

Opbevaringstemperaturen havde ikke sta­tistisk sikker indflydelse på moti­li­tets­faldet. I denne undersøgel­se blev der således ikke påvist forskel­le i holdbar­heden (udtrykt ved motiliteten) af sæden ved de to opbe­varin­gstem­pera­turer.

Sædens befrugtnings­evne kan ikke udtrykkes ved hjælp af motiliteten alene, men motilite­ten er den bedst afprøvede laboratorie-para­meter til vur­der­ing af befrugtningsevnen. En høj motilitet giver dog ingen garan­ti for gode reproduktion­s­resultater.

Et fald i motiliteten i den færdigfortyndede sæd i størrelsesordenen fra 1 til 4 pct. svarer til, at antallet af motile sædceller i dosen reduceres med fra 20 til 80 millioner. Der er - trods de statistisk sikre forskelle - tale om en relativt lille reduktion i antallet af motile sædceller.

Forskellene i motilitetsfald øges i takt med, at sædens alder stiger. Dette er helt i overensstemmel­se med, hvad der for­ventes, og netop derfor blev der her i undersøgelsen foretaget motili­tetsvur­deringer helt op til 96 timer efter opsamling. I prak­sis anbefales det, at sæden anvendes indenfor tre døgn efter opsam­ling, og langt det meste anvendes indenfor de første 48 timer.

Det er derfor ikke realistisk at tro, at en ændring af fortyndings­proceduren fra den nuværende procedure (procedure 1) til pro­cedure 2 vil medføre forbedrede reproduk­tionsresultater.

Da der er tale om et rent laboratorieforsøg, hvor kun en parameter er undersøgt, kan det ikke umiddel­bart forsvares at ændre den nuværende pro­cedure på KS-stationerne. Før sådanne ændrin­ger kan iværk­sættes, skal der udføres inse­minerings­forsøg med efterfølgen­de sammenligning af faringsprocent og kuldstørrelse for hver procedure.