Koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved dna-farvning

SAMMENDRAG

I samarbejde med Slagteriernes Forskningsinstitut blev der i perioden maj 1990 til september 1994 udarbejdet en ny metode til koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved DNA-farvning. Princippet i metoden er, at et fluorochrome (farvestof) tilsættes sæden, trænger ind i de enkelte sædceller og går i forbindelse med DNA i sædcellen, hvorved der dannes et fluorescerende kompleks.

I de første undersøgelser anvendtes fluorochromet Hoechst 33258. Undersøgelserne afklarede temperatur og tidsafhængighed, samt om der ved fortyndingsrækker indenfor samme sædopsamling var linearitet mellem fluorescensudslaget og fortyndings­graden. Dernæst blev det undersøgt, om der var bag­grundsstråling fra fortyndingsmediet, farvereagen­set eller sædplasmaen. Fluorometer­metoden blev i en forundersøgelse vurderet ved samtidig koncentrationsbe­stemmelse af 15 opsamlinger ved fluorometri, fotometri og ved tæl­ling. Fluorometermetoden viste her mindst lige så god korrelation til kon­centrationen bestemt ved tælling som fotometermetoden. Metoden blev justeret efter en tilsvarende hollandsk metode og nye undersøgelser indikerede, at metoden blev mere følsom og at lineariteten blev forbedret.

I den seneste undersøgelse blev der anvendt to fluorochromer: Hoechst 33258 og DAPI til koncentrationsbestemmelse af 50 opsamlinger. Usikkerheden på koncentrationsbe­stemmelsen ved fluorometri var i denne undersøgelse større end den tilsvarende usikkerhed ved fotometri. På baggrund af disse resultater kan fluorescensmetoden ikke umiddelbart anbefales til koncentrationsbestemmelse af ornesæd.

BAGGRUND

På de danske KS-stationer foretages kon­centrationsbestemmelse af ornesæd ved hjælp af et fotome­ter. Meto­den er behæftet med en betydelig usikker­hed. På grund af denne usikkerhed ud­nyttes den enkelte sædop­samling ikke optimalt, idet der må arbej­des med en sikkerheds­margin af sædceller til hver sæddose.

Ved fluorescensmetoden tilsættes et speci­elt farvestof - et fluorochrome - til sæden. Farvestoffet binder sig til DNA'et i sæd­cellen, hvorved der dannes et kompleks, som afgiver et fluorescerende lys. Den afgivne lysmængde afhænger af mængden af DNA og dermed af antallet af sædcel­ler.

Formålet med undersøgelsen var at ud­arbejde en standardkurve til fotometret samt en standard kurve til fluorometret med henholdsvis DAPI og Hoechst 33258. Ud fra spredningen på såvel hældningen som skæringen for standardkurven for de tre metoder var det muligt at vurdere metoderne i forhold til hinanden.

MATERIALE OG METODE

I samarbejde med Slagteriernes Forsk­ningsinstitut og KS-stationerne er der foretaget en metodeudvikling jf. delrappor­terne 1-8 fra Slagteriernes Forsknings­institut og DS.

Undersøgelserne blev gennemført på Slagteriernes Forskningsinstitut i perioden fra maj 1990 til september 1994 i sam­arbejde med Hatting Ringsted. Forunder­søgelserne er beskrevet i detaljer i del­rapporterne 1-7. Den endelige afprøv­ning af den udviklede metode er beskrevet i ne­denstående samt i delrapport nr. 8.

I den endelige afprøvning af den udviklede metode indgik prøver fra 50 sædopsam­linger (37 forskellige orner).

Koncentrationen af sædceller i hver op­samling blev bestemt ved tælling i et Thomahæmocy­tometer. Tællingen blev foretaget ved, at der - med en konstant fortyndingsgrad - blev fremstillet en for­tyndet sædopløsning, hvorefter tællekam­meret (Thomahæmocytometret) blev fyldt med den fortyndede sædopløsning. Tælle­kam­meret blev derefter anbragt i mikro­skop, og ved 400 ganges forstørrelse blev an­tallet af sædceller i et givet rumfang (0,02 mm³) talt. Tællingerne blev udført som egentlige dobbeltbe­stemmelser, idet to personer uafhængigt af hinanden har udført hver en tælling pr. opsamling. Der er således foretaget to tælle-fortyndinger, to kammer­fyldninger og to tællinger for hver for­tyndet sædop­løsning.

Sideløbende blev der udarbejdet standard­måling og fortyndingsrækker med fem fortyndinger for hver opsamling til såvel fotometer som fluorometer (Hoechst og DAPI) for at kunne opstille ligningen for standardkurven ved de tre metoder.

I fotometerstandardmålingen anvendtes en 40 ganges fortynding. I fluorometerstan­dardmå­lingen anvendtes en 200 ganges fortynding ved Hoechst-metoden (metode­beskrivelse for Hoechst 33258 fluorome­termålemetoden fremgår af bilag 1) og en 80 ganges fortynding ved DAPI-metoden (metodebeskrivelse for DAPI-fluorometer­målemetoden fremgår af bilag 2).

Fortyndingsrækkerne fremstilledes på baggrund af koncentrationen bestemt ved tælling.

På baggrund af koncentrationen bestemt ved tælling fremstilledes et såkaldt forlag til fotometret med en forventet koncentra­tion på ca. 20 mio. sædceller pr. ml. Herudfra fremstilledes fortyndingsrækken for fotometret (tabel 1).

På baggrund af koncentrationen bestemt ved tælling fremstilledes et Hoechst-fluo­rometerfor­lag med en forventet koncentra­tion på ca. 4 mio. sædceller pr. ml. Ud fra dette forlag blev fortyndings­rækken for Hoechst fluorometermålingen (tabel 2) fremstillet. Tilsvarende fremstilledes et DAPI-fluoro­meterforlag med en forventet kon­centra­tion på ca. 10 mio. sædceller pr. ml. Ud fra dette forlag fremstilledes for­tyn­dings­rækken for DAPI-fluorometer­ må­lingen (tabel 2).

Ved måling i fluorometret tilsattes hen­holdsvis 2,00 ml Hoechst-farveopløsning og 3,00 ml DAPI-farveopløsning, således at totalrumfanget i begge tilfælde blev 4,00 ml.

Ud over ovenstående fluorometer-målinger blev der dagligt foretaget blindværdi-målinger for såvel Hoechst som DAPI. Blindværdien er et udtryk for, hvor stort et måle-udslag der stammer alene fra for­tynder og farveopløsninger.

RESULTATER OG DISKUSSION

Der blev udtaget prøver fra 50 opsam­linger (fra 37 forskellige orner) med ex­tinktionsværdier fra 0,11 til 0,65 (stan-dar­da­flæsning i fotometer).

Tidligere undersøgelser har vist, at der er en sammenhæng mellem fotometerudslag og koncentration bestemt ved tælling, og at der opnås en lineær sammenhæng ved transfor­mation af måleværdierne med den naturlige logaritme (ln).

Det ses umiddelbart af figurerne,  at der er stor spredning for såvel fotometer som for begge fluorometer-metoderne, når stan­dardmålingerne sammenholdes med kon­centrationen fundet ved tælling. For alle tre metoder gælder, at punkterne burde have ligget omkring en ret linie. (Figur 1 - 3 er ikke medtaget i denne tekst, men kan rekvireres ved henvendelse til: Landsudvalget for Svin, DANSKE SLAGTERIER, Axeltorv 3, 9 København V., tlf. 33 11 60 50. (Red.))

Sammenhængen mellem koncentrationen bestemt ved tælling og foto- henholdsvis fluorometerudslag kan beskrives ved formlen: Koncentrationen = exp(a + b ´ ln(udsla­get)). Tilpasset en ret linie til punkterne på figur 1 - 3 angiver a skærin­gen og b hældningen.

For hver opsamling er der udarbejdet en fortyndingsrække, og for hver af disse er den bedste rette linie gennem fortyndings­rækkepunkterne blevet bestemt ved simpel regression.

Den endelige hældning er angivet som et gennemsnit af hældningerne fra hver fortyndings­række, i alt 50.

Spredningen på hældningen var lidt lavere ved fotometermetoden end ved de to fluo-r­ometer­metoder.

Skæringen blev estimeret ud fra sammen­hørende bestemmelser af koncentrationen fundet ved tælling (T) og fotometerværdi henholdsvis fluorometerværdi (F): Skæring = ln(T) - b´ln(F).

Der indgår værdier fra 50 opsamlinger.

Spredningen på bestemmelsen af skærings­punktet er noget større for fluorometerme­toderne end for fotometret.

Den statistiske bearbejdning er også blevet foretaget efter blindværdi-korrektion af de to fluorometer-metoder. I Hoechst-meto­den blev korrigeret med et gennem­snit for blindværdier­ne gennem hele for­søget (= 75). I DAPI-metoden blev korri­geret med den faktiske blindværdi for den pågælden­de forsøgsdag. Korrektionen ændrede ikke væsentligt på resultaterne.

Koncentration ved fotometermetoden kan herefter beregnes ud fra følgende ligning:

Konc = exp(9,158 + 0,9392 ´ ln(foto­meteraflæsning)).

Koncentration ved fluorometermetoden med Hoechst-farvestoffet kan beregnes ud fra følgende ligning:

Konc = exp(7,224 + 0,5006´ ln(fluoro­meteraflæsning, Hoechst)).

Koncentration ved fluorometermetoden med DAPI-farvestoffet kan beregnes ud fra følgende ligning:

Konc = exp(5,222 + 0,6791705´ ln(flu­orometeraflæsning, DAPI)).

Forskellen mellem koncentrationen fundet ved tælling og koncentrationen fundet ved fotometri er et udtryk for overensstemmel­sen mellem de to metoder; tilsvarende gælder for forskellen mellem tællekon­centration og fluorometerkoncentration bestemt henholdsvis med DAPI og med Hoechst.

Koncentrationsbestemmelse ved de to fluorometermetoder afveg mere fra kon­centrationen bestemt ved tælling end foto­metret. Spredningen på Hoechst-metoden var i denne undersøgelse væsentlig større end på fotometret. Spredningen på DAPI-metoden var også større end ved fotome­ter-metoden, selv om spredningen på DAPI-metoden var klart mindre end på Hoechst-metoden.

Resultatet i denne undersøgelse under­bygger resultatet i den foregående under­søgelse (beskrevet i delrapport nr. 7).

Fluorescensmetoden kan på baggrund af denne undersøgelse ikke umiddelbart anbefales til koncentrationsbestemmelse af ornesæd. Det skal dog nævnes, at der eventuelt er mulighed for at udvikle fluo­rescens-metoden til også at kunne skelne mellem levende (ubeskadigede) og døde (beskadigede) sædceller. I ube­skadi­gede sædceller trænger fluorochro­merne ikke gen­nem cellemem­branen. Der dannes derfor ikke noget fluorescerende DNA-farve kom­pleks, da DNA'et ligger be­skyttet i sædcelle­kernen. Selv om spred­ningen på kon­cen­tra­tions­bestem­mel­sen ved fluoro­metri til­synela­dende er mindst lige så stor som ved fotometri, er der altså muligvis vigtige ekstra infor­mationer at hente om sæden ved anvendel­se af en fluoroescens-meto­dik.

BILAG 1

Metodebeskrivelse for fluorometer-må­ling af sædcellekoncentrationen i orne­sæd med HOECHST 33258

Farve og bølgelængde

med en båndbredde på 5nm.

Kemikalier:            1) NaCl, Natriumklorid p.a.

                               2) C4H11NO3, TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan p.a.

                               3) C25H37N6O6Cl3, Bisbenzimide HOECHST H33258 (Fluorochrome)

                               4) C10H14N2Na2O8·2 H2O, EDTA-dinatriumsalt (Titriplex III) p.a.

                               5) ionbyttet H2O fx Milli-Q vand

                               6) C6H8O7·1 H2O, citronsyre-1-hydrat

                               7) NaOH, 10 N natrium-hydroxid

Reagenser:             a) EDTA-buffer

                               5,8 gram natriumklorid (1), 1,21 gram TRIS (2), 5,00 gram citronsyre (7) og

                               3,722 gram EDTA (4) opløses med vand (5) ad 1.000 ml. Der tilsættes

                               natrium-hydroxid (7) til pH 7,4 (pH-meter). Bufferen frem­stilles frisk før hver

                               analyserunde.

                               b) Farve-opløsning

                               0,01 gram Bisbenzimide (3) opløses og fortyndes med EDTA-buffer (a) ad 100

                               ml.

                               Fremstilles frisk før hver analyserunde.

Fremgangsmåde:   En mængde af farveopløsningen (b) fortyndes 50 gange med EDTA-buffer (a).

                               Prøverne med en fotometerværdi på 15 - 50 fortyndes 50 gange med EDTA-

                               buffer (a).

                               Umiddelbart herefter afpippeteres 2 ml fortyndet prøve og 2 ml fortyndet

                               farveopløsning i 1 cm's plastkuvette. Låg sættes på kuvetten og denne vendes

                               manuelt 20 gange for at blande prøve og farve. Herefter placeres kuvetten i

                               mørke ved stuetemperatur i 5 minutter (stopur). Herefter måles fluorescens-

                               intensiteten ved en exitationsbølgelængde på 355 nm og en emmisions-

                               bølgelængde på 470 nm - begge med en båndbredde (spalteåbning) på 5 nm.

BILAG 2

Metodebeskrivelse for fluorometer-måling af sædcellekoncentrationen i ornesæd med DAPI-reagens.

Farve og bølgelængde

med en båndbredde på 5nm.

Kemikalier:            1) NaCl, Natriumklorid p.a.

                               2) C4H11NO3, TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan p.a.

                               3) C10H14N2Na2O8·2 H2O, EDTA-dinatriumsalt (Titriplex III) p.a.

                               4) ionbyttet H2O fx Milli-Q vand

                               5) C6H8O7·1 H2O, citronsyre-1-hydrat

                               6) NaOH, 10 N natrium-hydroxid

Reagenser:             a) EDTA-buffer:

                               5,8 gram natriumklorid (1), 1,21 gram TRIS (2), 5,00 gram citronsyre (6) og

                               3,722 gram EDTA (3) opløses med vand (4) ad 1.000 ml + 0,1 ml nonidet P

                               40. Der tilsættes natrium-hydroxid (6) til pH 7,4 (pH-meter). Bufferen

                               fremstilles frisk før hver analyserunde.

                               b) farve-opløsning: 2mM DAPI-opløsning:

                               A: 1,4 mg DAPI opløses i 100 ml EDTA-buffer (a)

                               B: 10 ml of A opløses i 190 ml EDTA-buffer (a)

                               (molekyl-vægten for DAPI er 350,2)

                               Alle reagenser fremstilles frisk før hver analyserunde.

Fremgangsmåde:   2 ml råsæd fortyndes med 48 ml EDTA-buffer (a). Fra denne opløsning

                               udtages 1 ml, som fortyndes med 3 ml farve-opløsning (b) i en engangs-

                               cuvette. Fluorescenssignalet aflæses efter 30 sekunder.

                               Målingerne foretages ved stuetemperatur.