Test af Nucleocounter SP100, MiniTüb SDM5 og Corning 254 til koncentrationsbestemmelse af råsæd

På DanAvls KS-stationer anvendes i dag et Corning 254 fotometer til koncentrationsbestemmelse af råsæd. Metoden er billig, hurtig og nem at anvende. Da metoden anses for at være for unøjagtig, har det været ønsket at undersøge andre metoder til koncentrationsbestemmelse.

Ved anvendelse af mere nøjagtige metoder til koncentrationsbestemmelse kan der med samme kvalitetskrav produceres flere sæddoser end hidtil. Dette kan lade sig gøre, når kvalitetskravet antages at være målt som en nedre grænse for antallet af sædceller i en sæddose. Indførsel af en ny metode til koncentrationsbestemmelse af råsæd skal således opvejes af, at der kan produceres flere doser pr. ejakulat, hvorved indførsel af ny metode som minimum er omkostningsneutral.

I fremtiden vil anvendelse af lavere antal sædceller pr. insemineringsdosis formentlig blive aktuelt. Med Corning 254 vil det ikke være muligt at udføre analyser af råsæd nøjagtigt nok til at kunne nedsætte antal sædceller pr. insemineringsdosis. Årsagen til dette er, at nøjagtigheden på koncentrationsbestemmelsen er for lav.

En mere nøjagtig metode til koncentrationsbestemmelse fås med FACSCount AF System. Metoden er veldokumenteret og anses som den gyldne standard for koncentrationsbestemmelser. Metoden anses dog ikke mulig til anvendelse i produktionen af sæddoser. Det er derfor ønskeligt med et mere nøjagtigt apparat end Corning 254 og mere brugervenligt end FACSCount AF System.

Formålet med afprøvningen var at undersøge præcision og nøjagtighed af Nucleocounter SP100 (ChemoMetec, Allerød, Danmark), MiniTüb SDM5 (MiniTüb, Landshut, Tyskland) og Corning 254 (Sherwood Scientific Ltd, Manchester, UK) på koncentrationsbestemmelser på råsæd. De målte koncentrationer blev sammenlignet med FACSCount AF System (BD Bioscienses, Franklin Lakes, NJ, USA). Sekundært blev apparaternes brugervenlighed med henblik på anvendelse i produktionen på KS-stationerne evalueret. Afprøvningen blev udført med økonomisk støtte fra DanAvl KS-stationerne.

Råsædsprøver fra 120 ejakulater blev undersøgt på syv forskellige dage. Alle ejakulater blev undersøgt som dobbeltbestemmelser med følgende apparater: Nucleocounter SP100 (SP100); MiniTüb SDM5 (SDM5); Corning 254 (C254); og FACSCount AF System (FACS).

Ved pipettering blev pipettespidsen aftørret inden det ønskede volumen blev afsat. Alle pipetteringer blev foretaget som overskudspipettering.

For at sikre, at oplandingen af råsæden var tilstrækkelig, blev analyse af sædkoncentrationen først gennemført med flowcytometri. Hvis koncentrationen mellem dobbeltbestemmelserne, målt med flowcytometri, afveg mere end 10 pct., blev råsædsprøven blandet grundigt inden en ny dobbeltbestemmelse blev udført. Først derefter blev koncentrationen målt med de andre apparater.

Nucleocounter SP100

Nucleocounteren er et tællekammerbaseret apparat til bestemmelse af koncentrationen af celler. En prøve opsuges med NucleoCassetten, som indeholder et farvestof, der farver cellerne. Apparatet affotograferer en del af prøven placeret i et kammer i NucleoCassetten. Antallet af celler i et bestemt volumen af prøven bestemmes ved billedbehandling af fotografiet og sædkoncentrationen kan således bestemmes.

Ved undersøgelsen blev NucleoCasetter med interval i kammerdybden på 4 µm anvendt. Dybden blev angivet med dot-kode, som under analysen blev aflæst af apparatet.

Hver råsædsprøve blev fortyndet 1:201 ved at pipettere 50 µl råsæd med FACSCount pipette til et 13 ml PP-rør, som blev tilsat 10,0 ml Reagent S100 (ChemoMetec) med Dispensette III (Bie & Berntsen). Fra den fortyndede råsædsprøve blev en prøve opsuget med NucloeCassetten og analyseret i apparatet. Metoden bygger på en billedbehandling af et affotograferet område i kammeret. Såfremt en luftboble kunne erkendes i dette billede, blev analysen lavet om.

MiniTüb SDM5

Analyse blev foretaget i henhold til manual for apparatet (MiniTüb). Hver råsædsprøve blev fortyndet 1:51 ved at pipettere 80 µl råsæd til en plastik-cüvette, som blev tilsat 4,00 ml isotonisk saltvand. Cüvetten blev vendt tre gange inden analyse i apparatet. Kalibrering af apparatet var foretaget af producenten.

Corning 254

Hver råsædsprøve blev fortyndet 1:40 ved at pipettere 250 µl råsæd til en rund glas-cüvette, som blev tilsat 9,75 ml EDTA-fortynder. Den fortyndede råsædsprøve blev blandet inden analyse i fotometeret. Koncentrationsbestemmelserne var baseret på data fra tidligere kalibrering.

FACSCount AF System

Analyse med FACSCount AF System blev foretaget i henhold til valideret procedure (Hansen et al., 2002). Hver råsædsprøve blev fortyndet 1:101 ved at pipettere 50 µl råsæd med FACSCount pipette til 13 ml PP-rør, som blev tilsat 5,0 ml EDTA-fortynder. Derfra blev udtaget 50 µl med FACSCount pipette, som blev tilsat et analyserør. Analyserøret blev efterladt i fem minutter til indfarvning inden analyse blev foretaget i flowcytometeret.

Statistisk analyse

Beregningerne er foretaget på utransformerede data, idet en log-transformation kun stabiliserede variationen for SP100 og FACS og ikke for C254 og SDM5. Ved beregning af CV og korrelation indgik samtlige observationer.

Regressioner og CV mellem apparaterne er udregnet ved sammenligning mellem 1. bestemmelse fra apparatet, sammenlignet med gennemsnittet mellem 1. og 2. bestemmelse målt med FACS, dette blev gjort ved hjælp af PROC MIXED i SAS, hvor ORNE indgik som tilfældig effekt. CV mellem apparaterne blev udregnet ud fra estimeret varians og estimat for gennemsnit.

Der blev for Nucleocounteren fundet fem analyser, som på grund af luftbobler i billedet måtte analyseres om.

Apparaternes præcision

Apparatets præcision kan defineres som apparatets evne til ved gentagne målinger af samme ejakulat at opnå det samme resultat hver gang. Præcisionen blev i dette studie opgjort som variationskoefficienten (CV) for dobbeltbestemmelserne af koncentrationen. Tidligere studier af FACS (Hansen et al, 2002) har vist CV på 2,7 pct. ved koncentrationsbestemmelse af råsæd. I dette studie var CV for dobbeltbestemmelser for FACS, SP100, SDM5 og C254 henholdsvis 3,3 pct.,3,8 pct., 3,5 pct. og 3,4 pct. Variationskoefficienten for dobbeltbestemmelser med FACS var signifikant højere end de 2,7 pct. rapporteret i 2002 (Hansen et al, 2002). Årsagen hertil kendes ikke.

For FACS og SP100 afhænger præcisionen i stor grad af, hvor mange sædceller der tælles ved hver koncentrationsbestemmelse. Årsagen til dette er, at spredningen på middelværdien, som indgår i beregningen af CV, afhænger af hvor mange sædceller der bliver talt, - spredningen på middelværdien falder, når der tælles flere sædceller. Med SP100 blev gennemsnitlig talt cirka 2.700 celler pr. analyse og cirka 7.000 for FACS. Disse tal medfører en teoretisk opnåelig CV for dobbeltbestemmelserne på 1,9 og 1,2 pct. for henholdsvis SP100 og FACS. Dog bidrager pipettering, opblanding af råsæd og stikprøveudtagningen yderligere til variationen. For SP100 bidrager forskellene i dybden på kamrene, som er de før nævnte spring på 4 µm i NucleoCassetterne, tillige med variation. Fremover produceres NucleoCassetterne med intervaller på 2 µm i dybden på kamrene, hvilket burde medføre bedre præcision. For FACS bidrager usikkerheden i antallet af referencepartikler i analyserørene med variation. Det er fra producenten oplyst, at CV for antallet af referencepartikler i analyserørene er maksimalt 2,4 pct. Med det ovenstående taget i betragtning er den opnåede præcision for FACS og SP100 tilfredsstillende.

SDM5 og C254 måler koncentrationen ved en beregning ud fra mængden af lys, der absorberes i den fortyndede råsædsprøve. Disse apparater får derfor lavere spredning i koncentrationsbestemmelserne, idet forholdene, som betyder noget for koncentrationsbestemmelsen, er relativt konstante for hvert ejakulat.

Apparaternes nøjagtighed

Idet FACS i dette studie blev anvendt som gylden standard, kan apparatets nøjagtighed defineres som de testede apparaters evne til at opnå samme resultat som FACS.

Ved sammenligning af apparaterne fås generelt større korrelation mellem SP100 og FACS end mellem FACS og både SDM5 og C254 (tabel 1). Det samme anskueliggøres ved CV for de enkelte apparater i forhold til målingerne foretaget med FACS, hvor CV for SP100 er halvt så stor som for SDM5 og C254.

a: Signifikant forskellig fra 1,0
b: CV er opgivet som variationskoefficienten i forhold til FACS.

Hældningen for regressionskurverne er for SDM5 og C254 meget forskellig fra 1,0 (tabel 1 og figur 1 og 2). Kalibreringen af C254 blev foretaget ud fra en fortyndingsrække, således at sædkoncentrationer i hele fotometerets måleområde var repræsenteret. Forskellene mellem fortyndingerne blev fremstillet kunstigt ved tilsætning af varierende mængde EDTA til en given råsædsprøve. Forskellene mellem koncentrerede og ikke-koncentrerede råsædsprøver var således ikke kun sædceller, men også mængden af sædplasma. Ved normal undersøgelse af sædkoncentrationen er mængden af sædplasma konstant. Ved kalibreringen er derved opnået en hældning, der er baseret på forskelle i både indholdet af sædplasma og sædceller. Idet det forventes, at sædplasma absorberer lys, betyder førnævnte forhold ved kalibreringen, at hældningen formentlig er estimeret forkert. Hvorvidt det samme gælder for kalibreringen af SDM5 vides ikke. Hældningen for SP100 er ikke signifikant forskellig fra 1,0 (tabel 1 og figur 3). Kalibreringen af SP100 er ligesom for C254 opnået ved anvendelse af fortyndingsrækker, men udstyret er ikke følsomt for andet indhold i råsæden end sædceller, og derfor er hældningen estimeret mere korrekt.

Figur 1. Regression mellem koncentrations-målinger (mio. sædceller pr. ml) med FACS og SDM5. Stiplet linie angiver regressionslinie. Optrukket linie angiver optimal linie.

Figur 2. Regression mellem koncentrations-målinger (mio. sædceller pr. ml) med FACS og C254. Stiplet linie angiver regressionslinie. Optrukket linie angiver optimal linie.

Figur 3. Regression mellem koncentrations-målinger (mio. sædceller pr. ml) med FACS og SP100. Stiplet linie angiver regressionslinie. Optrukket linie angiver optimal linie.

Apparaternes brugervenlighed

Apparaternes anvendelighed blev vurderet som tidsforbrug pr. analyse, kompleksitet af arbejdet og mængden af koncentrationsbestemmelse med fejl i analysen.

Brugervenligheden af fotometrene C254 og SDM5 var god, idet fortyndingen af prøverne var simpel og betjeningen af apparatet var nem. Resultatet fra målingen med fotometeret blev opgivet som en koncentration, og resultatet skulle derfor ikke fortolkes.

Fortyndingen af prøver til SP100 var ligeledes nem, dog blev resultatet af analysen opgivet som en koncentration med tilhørende billede af de talte sædceller. Brugeren skal forholde sig til, hvorvidt analysen er korrekt, hvilket bevirker, at anvendelsen bliver mere kompliceret end for fotometrene.

Anvendelsen af udstyret kræver derfor lidt mere oplæring end anvendelsen af fotometrene. Samlet vurderes det dog, at apparatets brugervenlighed er fuldt tilstrækkelig til anvendelse på KS-stationerne.

Konklusion

SDM5 og C254 samt SP100 har alle en tilfredsstillende præcision i analyserne. Dog udviser SDM5 og C254 en lav nøjagtighed ved sammenligning med FACS. Dette bevirker, at SDM5 og C254 finder samme koncentration ved flere målinger på samme ejakulat, men at koncentrationen ikke altid er korrekt. Årsagen til dette menes at være forhold i råsæden, som er forskellige mellem ejakulaterne. Disse forskelle kan fx være varierende indhold af gelatinøse partikler i råsæden. Således kan disse forskelle være medvirkende årsag til den manglende nøjagtighed.

Målinger foretaget med SP100 bygger på affotografering af en råsædsprøve, og derved en tælling af antallet af sædceller i et bestemt volumen. Apparatet er derfor ikke i samme grad følsomt over for fx gelatinøse partikler i råsæden. Resultaterne viser god præcision ved gentagne målinger på samme ejakulat og god nøjagtighed i analyserne. Endvidere er apparaturets brugervenlighed tilfredsstillende til anvendelse på KS-stationer.

Hansen C, Christensen P, Stryhn H, Hedeboe AM, Rode M, Boe-Hansen G. Validation of the FACSCount AF System for determination of sperm concentration in boar semen. 2002. Reproduction in Domestic Animals. 37: 330-334.

MiniTüb. Instructions, photometer SDM 5. Ref. no. 12300/0005. Version 01/02. MiniTüb, Landshut, Tyskland.

Deltagere:
Laboratoriemedarbejder: Cicilie Line Jensen, Hatting-KS.
Statistiker Mai Britt Friis Nielsen, Landsudvalget for Svin

Samarbejdspartnere
ChemoMetec A/S, Allerød, Danmark

Afprøvningsnr: 765