Stabilitet af antibiotikakombinationen amoxicillin og gentamycin som additiv til EDTA-ornesædsfortynder - målt over en periode på 12 uger

Ornesæd til inseminering skal fortyndes med sædfortynder tilsat antibiotika. Antibiotika er tilsat for at inaktivere bakterier som måtte findes i sæden. En antibiotikakombination bestående af amoxicillin og gentamycin til EDTA-ornesædsfortynder er udviklet [1]. Antibiotikakombinationen blev udviklet til anvendelse i tørform som tilsætning til 10 liter EDTA-ornesædsfortynder umiddelbart inden anvendelse.

Risikoen for udvikling af allergi er større ved arbejde med antibiotika i tørform end i opløst eller opslæmmet form. Det var derfor et ønske, at antibiotikakombinationen kunne produceres i opløst form, således at risikoen for allergi blev formindsket. Stabiliteten af antibiotikakombinationen opløst i EDTA-ornesædsfortynder blev derfor undersøgt [2, 3, 4]. Resultaterne viste en konstant biologisk aktivitet i 28 dage for kombinationen i brugskoncentrationen (100 µg/ml af begge antibiotika).

Ved produktionen af antibiotikakombinationen produceres et koncentrat á 100 ml indeholdende antibiotika i EDTA-ornesædsfortynder. Dette koncentrat indeholder antibiotika nok til 10 liter EDTA-ornesædsfortynder. Antibiotikakombinationen kan ikke opløses fuldstændigt og formuleringen er således en opslæmning. Tidligere er antibiotikakombinationens stabilitet undersøgt i brugsopløsning, men ikke som koncentrat.

Formålet med denne afprøvning var at undersøge stabiliteten af antibiotikakombinationen i koncentreret form opslæmmet i EDTA-ornesædsfortynder. Stabiliteten blev vurderet ud fra biologisk aktivitet og pH. Stabiliteten blev kontrolleret umiddelbart efter produktion, 29 dage efter, 42 dage efter og efterfølgende ugentligt frem til 85. dag efter produktion. Det var formålet at vise, hvorvidt holdbarheden af antibiotikakombinationen kan fastsættes til 10 uger.

Redegørelse

Undersøgelsen for biologisk aktivitet blev udført i perioden fra september 2003 til december 2003 på Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, Institut for Veterinær Patobiologi (KVL) (Bilag 1). Biologisk aktivitet blev vurderet ud fra hæmningszone ved dyrkning af testbakterien Escherichia coli (K1E1). Foruden stabiliteten blev tre flasker undersøgt for kimtal ved Fødevareregion Vejle efter DS/EN ISO 6222:2000. Der blev ved kimtalsundersøgelsen ikke påvist bakteriel vækst.

Resultaterne fra undersøgelsen viste konstant biologisk aktivitet i hele perioden. pH faldt lidt igennem perioden, hvilket stemmer godt overens med tidligere resultater [2]. Faldet i pH havde dog ikke indflydelse på den biologiske aktivitet.

Såfremt der kunne påvises bakteriel vækst ved kimtalsundersøgelse, ville bakterierne være resistente over for antibiotikakombinationen. Det må således betragtes som et krav, at kimtalsbestemmelse af antibiotikakombinationen skal være negative, hvilket også var opfyldt i denne afprøvning.

Det konkluderedes i bilag 1, at holdbarheden af den undersøgte batch af antibiotikakombination i EDTA-ornesædsfortynder var mindst 85 dage, og at konklusionen ville styrkes såfremt flere undersøgelser blev udført. Idet kun én batch er undersøgt og resultaterne ikke er reproduceret i en anden undersøgelse, må det derfor anbefales, at holdbarheden på fremtidige batch af antibiotikakombinationen amoxicillin og gentamycin i EDTA-ornesædsfortynder fastsættes til 70 dage fra produktionsdagen. Således er der taget højde for ovenstående ved at inkludere en sikkerhedsmargin på cirka 2 uger.

Samarbejdspartnere

Undersøgelsen er udført i samarbejde med:
  - Lektor, Bent Aalbæk, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole
  - Sygehusapoteker, Jytte Bjerregård, Apoteket, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole
  - Cand. pharm. Helle Rau, Apoteket, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole

  
Stabilitet af ”Antibiotika Cocktail” bestående af vandig suspension af gentamycin og amoxicillin.
  
Rapport udarbejdet af
Bent Aalbæk og Jytte Bjerregaard
Institut for Veterinær Patobiologi, KVL, 2003

Ornesæd til inseminering fortyndes med sædfortynder tilsat antibiotika med det formål at inaktivere bakterielle smitstoffer. En ny antibiotikakombination til ornesædsfortynderen EDTA er udviklet. Kombinationen består af gentamycin og amoxicillin i koncentrationen 100 mikrogram af begge antibiotika pr. ml færdigfortyndet sæd.

Tidligere undersøgelser af gentamycin og amoxicillin, som enkeltvis er tilsat EDTA-fortynder, har vist, at den antibakterielle aktivitet overfor testbakterier var intakt i op til 11 døgn efter tilsætning af amoxicillin og 17 døgn efter tilsætning af gentamycin (1). Samtidig viste måling af ledningsevne og pH, at disse parametre ikke ændrede sig i måleperioden (1), hvilket indikerede, at der ikke var sket ændringer af indholdsstofferne.

Formuleringen af antibiotikakombinationen var tidligere som tørstof leveret i særskilte beholdere. For at minimere risikoen for udvikling af allergi hos det personale, som arbejder med antibiotika på KS-stationerne, var det af interesse at få undersøgt andre mulige formuleringer af antibiotikakombinationen. Idealet er en formulering på flydende form af begge antibiotika sammenblandet. Denne formulering er genstand for nærværende undersøgelse.

I en anden undersøgelse (2) vurderedes stabiliteten af gentamycin og amoxicillin opløsninger målt som den biologiske aktivitet og pH i en periode på 28 dage. Målingerne blev foretaget på gentamycin henholdsvis amoxicillin i vandig opløsning, vandig opløsning af blanding af gentamycin og amoxicillin samt en opløsning af gentamycin og amoxicillin i EDTA-fortynder. Denne undersøgelse viste stabil biologisk aktivitet under de givne eksperimentelle betingelser i mindst 28 dage for gentamycin henholdsvis amoxicillin i vandig opløsning såvel som blandinger heraf i vandig opløsning og i EDTA-fortynder.

Formålet med nærværende undersøgelse var at måle den biologiske aktivitet af en vandig suspension af gentamycin og amoxicillin  ”Antibiotika Cocktail” (”AC”) over en længere periode end 28 dage.

Undersøgelsen er gennemført med assistance af cand. pharm. Helle Rau, farmakonom Randi Kronow og laborant Pia Rønnow Mortensen.

”Antibiotika Cocktail” (”AC”) er fremstillet den 29.september 2003 af Løvens Kemiske Fabrik (batch nr. 315262-1) i flasker indeholdende 100 ml suspension bestående af amoxicillin trihydrat og gentamycin sulfat. Til undersøgelsen er der udtaget et antal flasker fra tre produktionsfaser, nemlig  begyndelsen, midten og slutningen af produktionsdagen. Flaskerne opbevaredes ved 5°C. På undersøgelsesdagen sattes hver flaske til 10 liter EDTA-fortynder. På denne blanding foretoges bestemmelse af biologisk aktivitet uden og med behandling med penicillinase, som inaktiverer amoxicillin, således at der måltes biologisk aktivitet af henholdsvis amoxicillin plus gentamycin og af gentamycin alene. Som standard benyttedes friskfremstillet blanding af amoxicillin plus gentamycin i samme koncentration som brugsfærdig sædfortyner (100 µg pr. ml). Som negativ kontrol benyttedes sædfortynder uden antibiotika. Desuden måltes pH hver undersøgelsesdag på en vilkårligt udtaget flaske med ”Antibiotika Cocktail”.

Undersøgelserne er foretaget følgende datoer: 30/09/03, 28/10/03, 11/11/03, 18/11/03, 25/11/03, 02/12/03, 09/12/03, 16/12/03, 22/12/03 efter opbevaring i henholdsvis 1, 29, 43, 51, 58, 65, 72, 79 og 85 dage. Til hver undersøgelse benyttedes 3 flasker ”Antibiotika Cocktail” fra hver af de tre produktionsfaser.

Testopløsninger af brugsfærdig EDTA-fortynder
På undersøgelsesdagen fremstilledes brugsfærdig sædfortynder ved følgende procedure: En flaske ”Antibiotika Cocktail” omrystedes og sattes straks efter til 10 liter EDTA-fortynder (leveret fra KS-station Hatting, Ringsted), som dernæst blandedes ved omrystning to gange et halvt minut. Heraf udtoges 100 ml, som yderligere tilsattes 10,8 ml EDTA-fortynder, hvorved opnåedes en slutkoncentration på 100 µg amoxicillin og 100 µg gentamycin pr. ml, som er koncentrationen i brugsfærdig EDTA fortynder.

Procedure for aktivitetsbestemmelse uden penicillinasebehandling
Af de testopløsninger, som ikke penicillinasebehandledes, overførtes 50 µl til en papirdisk (13 mm papirdisks, Whatman cat. no. 2017013) svarende til 5 µg af hvert stof pr. disk.

Procedure for aktivitetsbestemmelse med penicillinasebehandling
Til penicillinasebehandling blev benyttet β-lactamase Fluca no. 61304, 25 mg,  der opløstes i 1 ml sterilt vand og fordeltes i Eppendorfrør a 32 µl. Opbevaret i fryser. Procedure for penicillinasebehandling: 125 µl opløsning af henholdsvis standard og testopløsninger (med 100 µg amoxicillin + 100 µg gentamycin pr. ml) sattes til et Eppendorfrør med 32 µl penicillinase. Efter henstand 1 time ved stuetemperatur udtoges 63 µl, som overføres til papirdisk, svarende til en dosering på 5 µg af hvert stof pr. disk.

Standard
Standarden fremstilledes således: Amoxicillinopløsning: 100  mg amoxicillin Sigma (A8523) sattes til 10 ml sædfortynder (= 10 000 µg/ml). 100 µl heraf sattes til 900 µl sædfortynder (= 1000 µg/ml). 200 µl heraf sattes til 800 µl sædfortynder (= 200 µg/ml). Gentamycinopløsning: 168 mg gentamycinsulfat (= 100 mg aktivt stof) sattes til 10 ml EDTA-fortynder (= 10 000 µg/ml). 100 µl heraf sattes til 900 µl sædfortynder  (= 1000 µg/ml). 200 µl heraf sattes til 800 µl sædfortynder (= 200 µg/ml). Den endelige standard, indeholdende amoxicillin (100 µg/ml) og gentamycin (100 µg/ml) fremstilledes ved blanding af lige dele amoxicillinopløsning og gentamycinopløsning.  Heraf er doseret 50 µl pr. disk, svarende til 5 µg af hvert stof pr. disk.

Negativ kontrol
Som negativ kontrol benyttedes EDTA-fortynder, 50 µl pr. disk.

Procedure for bestemmelse af biologisk aktivitet
De præparerede papirdisks deponeredes på Mueller Hinton agar (Oxoid CM337 tilsat 5% sterilt kalveblod), som forud podedes således: 50 µl Escherichia coli (K1E1) overnatskultur i Heart Infusion Broth (Difco) sattes til 10 ml steril isotonisk NaCl. 7 dråber heraf fordeltes på 14 cm petriskål med Mueller Hinton agar. Denne procedure resulterede i semikonfluerende kolonier. Efter 1 døgns inkubation ved 37 grader celsius aflæstes hæmningsdiametrene.

pH måling
På hver undersøgelsesdag måltes pH på en vilkårligt udtaget flaske med ”Antibiotika Cocktail”. pH måltes på PHM-220 pH-meter kalibreret i området 4-7. Opløsningerne tempereredes til stuetemperatur, før pH blev målt.

Undersøgelsesdatoerne var: 30/09/03, 28/10/03, 11/11/03, 18/11/03, 25/11/03, 02/12/03, 09/12/03, 16/12/03, 22/12/03 efter opbevaring i henholdsvis 1, 29, 43, 51, 58, 65, 72, 79 og 85 dage.

De målte hæmningsdiametre er anført i Tabel 1 (resultater uden penicillinasebehandling), Tabel 2 (resultater med penicillinasebehandling) og Tabel 3 (pH værdier).

Den negative kontrol (EDTA-fortynder) viste i ingen tilfælde hæmning. Standarderne viste hæmningszoner med middelværdi 21,9 mm for de ikke penicillinasebehandlede prøver og 18,8 mm for de penicillinasebehandlede prøver.

Hæmningszonerne for prøverne af brugsfærdig EDTA-fortynder fandtes at være af samme størrelsesorden som standarderne, uden forskel på produkter, der er udtaget først, midt og sidst på produktionsdagen og uden forskel på de tre individuelle flasker (Tabel 1 og 2).

I ”Antibiotika Cocktail” er påvist et pH fald i løbet af undersøgelsesperioden på ca. 0,5 enhed (Tabel 3).

I alle tilfælde er diskene tilført et volumen svarende til 5 µg gentamycin og 5 µg amoxicillin, således at hæmningszonerne er umiddelbart sammenlignelige. Der foretoges bestemmelse af biologisk aktivitet uden og med behandling med penicillinase, som inaktiverer amoxicillin. Den kombinerede biologiske aktivitet af gentamycin plus amoxicillin kommer således til udtryk i målingerne uden brug af penicillinase, medens den biologiske aktivitet i de penicillinasebehandlede prøver må tilskrives gentamycin. Den større hæmningszone, der i alle tilfælde ses hos de ikke penicillinasebehandlede prøver, må således tilskrives effekten af amoxicillin.

Den biologiske aktivitet for alle prøver er fundet identisk med standarderne, (Tabel 1 og 2) svarende til en aktivitet på 100 µg/ml amoxicillin og 100 µg/ml gentamycin. Den negative kontrol udviste i intet tilfælde hæmningszone. Der er ikke påvist forskel på den biologiske aktivitet af standarder og prøver, uanset tidspunkt på produktionsdagen, hvilket indikerer en ensartet opblanding og fordeling af suspensionen ved produktionen, ligesom det indikerer, at der ikke foreligger nogen negativ påvirkning af produktets biologiske aktivitet under produktionsforløbet.

Resultaterne for henholdsvis de penicillinasebehandlede og de ikke penicillinasebehandlede prøver fandtes stabile gennem undersøgelsesperioden, tydende på, at den biologiske aktivitet af begge antibiotika i ”Antibiotika Cocktail” er uændret gennem undersøgelsesperioden, som har strakt sig til 85 dage efter produktionen.

Under de givne betingelser, som inkluderer strikt overholdelse af opbevaringstemperatur og blandingsprocedure, er således påvist uændret biologisk aktivitet af den undersøgte batch af ”Antibiotika Cocktail” i 85 dage eller ca. 12 uger.

I litteraturen beskrives stabiliteten af enkeltstofferne amoxicillin og gentamycin som god. Således angives amoxicillin i suspension at være stabil 3 måneder ved stuetemperatur og i 12 måneder ved kold opbevaring (3) og injektionsvæsker med gentamycin er fundet at nedbrydes mindre en 10% ved opbevaring ved 37°C i 2,5-3 år (4).

I ”Antibiotika Cocktail” er påvist et pH fald i løbet af undersøgelsesperioden på ca. 0,5 enhed. Dette pH fald har ikke påvirket den biologiske aktivitet i perioden.

I denne undersøgelse er således vist, at den aktuelle batch var anvendelig i mindst 85 dage. Under forudsætning af, at man overholder alle betingelser for opbevaring af koncentratet og fremstilling af den færdige sædfortynder, tyder denne undersøgelse på en holdbarhed af koncentratet på mindst 85 dage. Denne vurdering, som baseres på undersøgelse af én batch, ville styrkes, hvis der forelå gentagne undersøgelser.