Effekt af inseminering på udskillelsen af prostaglandin - cellestudie

Hormonet oxytocin er bl.a. ansvarlig for sædtransporten hos søer i brunst via påvirkning af børens muskulatur til sammentrækning. En tidligere afprøvning med KS har vist, at der ved seksuel stimulation af søer til stående brunst, udover oxytocin, også bliver udskilt store mængder af lokalhormonet prostaglandin til blodbanen [1]. Prostaglandin bevirker også en sammentrækning af børen. Da begge hormoner giver signal til sammentrækning af børens muskulatur, kan dette bevirke, at børens muskulatur går over i en krampetilstand [2], [3]. Herved vil sæden sandsynligvis ikke blive transporteret til æggelederen, hvor befrugtningen finder sted, hvilket vil virke negativt på reproduktionsresultaterne.

Udover en stigning i blodets indhold af prostaglandin ved traditionel KS er en tilsvarende stigning i prostaglandin observeret ved anvendelse af dyb KS [4]. Ved dyb KS sættes først et kateter i børhalsen, hvorefter et inderkateter føres igennem børhalsen og ind i børkroppen. Forskellen mellem traditionel og dyb KS er, at sæddosen ved traditionel KS afsættes i børhalsen, mens den ved dyb KS placeres i børkroppen. Ved sidstnævnte KS-type vil sæddosen altså ikke komme i berøring med overfladen (slimhinden) af børhalsen, men alene slimhinden i børkroppen. Til forskel for traditionel og dyb KS er stigningen i hormonet prostaglandin ikke observeret ved bedækning med orne. Ved bedækning med orne afsættes sæden i børhalsen og sæden vil hermed komme i kontakt med slimhinden her og med slimhinden i børkroppen.

Formålet med afprøvningen var at få undersøgt, hvilke komponenter (sædplasma, fortynder eller kateter) der fremkalder stigningen i prostaglandin, observeret ved traditionel såvel som ved dyb KS, samt forsøge at afdække hvorfor denne stigning ikke observeres, når soen bedækkes af en orne.

Afprøvning blev udført af universitetslektor Andrzej Madej og forskningsingeniør Malgorzata Madej, Inst. för Anatomi, Fysiologi och Biokemi, Sveriges LantbruksUniversitet (SLU), Uppsala. Afprøvningen blev økonomisk støttet af DanAvls KS-stationer og Dansk Svineproduktion.

Celler

Der blev indsamlet celler fra slimhinden af børhals og børkrop fra to gylte på Institut för Anatomi, Fysiologi och Biokemi, SLU, Uppsala. Begge gylte var insemineret cirka fire timer før indsamlingen. Dyrene blev insemineret i anden eller tredje brunst efter indtræden af pubertet. Efter aflivning blev hele børen udtaget og slimhinde fra børhals og børkrop isoleret maksimalt 30 minutter efter slagtning. Der blev fremstillet renkulturer af både slimhinde- og bindevævsceller fra børhalsen samt renkulturer af slimhinde- og bindevævsceller fra børkroppen. Disse blev udsået i plader indeholdende 24 brønde i en koncentration på cirka 2,5 × 10⁵ celler pr. brønd [5], [6], [7].

Sædfortynder, sædkateter og sædplasma

I undersøgelsen blev anvendt EDTA-sædfortynderen. Fortynderen er den fortynder, som p.t. anvendes af DanAvls KS-stationer. Fortynderen består af EDTA (etylen-diamin-tetra-acetat), glukose, natriumcitrat og natriumbikarbonat. Fortynderen blev anvendt uden tilsætning af antibiotika.

Engangskateter med gul skumtip, importeret fra Hatting-KS, Danmark, blev anvendt. Kateterspidsen (skumgummi) blev klippet i små stykker og lagt i 30 ml destilleret vand i 24 timer ved 40 grader celsius. Herefter blev suspensionen filteret og den overskydende væske anvendt (kateterekstrakt).

Sædplasma blev fremstillet ved blanding af ejakulater fra to orner med normal befrugtningsevne. Råsæden blev centrifugeret to gange ved 2.000 g i 20 minutter ved 4 grader celsius. Efter sidste centrifugering blev sædplasma (supernatanten) afpippeteret og gemt ved ÷20 grader celsius indtil anvendelse.

Forsøgsdesign

Forsøgsdesignet fremgår af tabel 1. For alle celletyper blev sædfortynder, ekstrakt af sædkateter og sædplasma tilsat de enkelte brønde med celler i voluminer på 0 til 1,0 ml, hvor brønde som ikke blev tilsat noget fungerede som kontrol.

Analyse af totalprotein og prostaglandin

For hver brønd blev den analyserede andel af prostaglandin udtrykt i forhold til den fundne mængde totalprotein, med benævnelsen picogram prostaglandin pr. mikrogram totalprotein (pg prostaglandin/µg totalprotein). Herved blev der taget højde for usikkerheden for det præcise antal prostaglandin producerende celler pr. brønd.

Andelen af totalprotein blev bestemt i hver brønd som beskrevet af Badford [8]. Efter opløsning af celler blev cellesuspensionen (cellemedie og celler) farvet for tilstedeværende protein, og farveintensiteten målt ved 595 nm med et spektrofotometer. Resultatet blev sammenlignet med en standardkurve dannet ud fra målinger af kendte mængder farvet bovint serum albumin. Resultatet blev udtrykt som mikrogram totalprotein pr. ml (µg/ml).

Andelen af prostaglandin blev bestemt i mediet (væsken over cellerne) i hver brønd. Mediet blev analyseret for prostaglandinF_2alfa (PGF2alfa), nedbrydningsproduktet af PGF2alfa (15-keto-13, 14-dihydro-PGF2alfa) (PGFM) og prostaglandinE₂ (PGE2) ved immunoassay, ud fra forhandlerens forskrift samt som beskrevet af Kunavongkrit et al. [9]. Resultaterne blev udtrykt som picogram prostaglandin pr. ml (pg/ml).

For sædfortynder, ekstrakt af sædkateter og sædplasma blev der for hver koncentration (0 til 1,0 ml) lavet tre uafhængige gentagelser pr. celletype. For hver kontrolprøve (ingen tilsætning) blev der lavet 12 uafhængige gentagelser. Koncentrationen af prostaglandin blev opgjort som gennemsnittet af gentagelserne pr. prøve.

Til beskrivelse af data er alene anvendt beskrivende statistik det vil sige udregning af gennemsnit og spredning, da antallet af prøver ikke muliggør udregning af egentlige statistiske forskelle.

Der blev i alt analyseret 747 prøver for prostaglandin og totalprotein fordelt på 603 prøver med celler fra børhalsen og 144 prøver med celler fra børkroppen. Undersøgelse af celler fra børkroppens slimhinde kunne ikke gennemføres, da disse celler, uvist af hvilken årsag, ikke kunne gro tilfredsstillende efter udsåning.

Måling af prostaglandin blev derfor alene udført på slimhinde- og bindevævsceller fra børhalsen og bindevævsceller fra børkroppen.

I tabel 2 vises en samlet oversigt over effekten af sædfortynder, ekstrakt af sædkateter og sædplasma på tilstedeværende prostaglandin, fordelt på celletype.

Effekt af sædfortynder på celler fra børhals og børkrop

EDTA-sædfortynderen til sæd blev undersøgt med 0; 0,1; 0,2; 0,5 og 1,0 ml fortynder, efter både tre og 24 timer, tilsat celler fra børhalsen. Efter tre timer sås ikke en øget udskillelse af prostaglandin fra celler i børhalsen, men efter en eksponering i 24 timer sås en fordobling i udskillelsen af PGF2alfa fra børhalsens slimhindeceller. Koncentrationen af prostaglandin steg fra 8,6 til 17,5 pg/µg (figur 1). Der sås ingen ændring i udskillelsen af PGFM og PGE2 af tilsætningen i forhold til kontrolgruppen.  

Der sås ingen stigning i udskillelsen af prostaglandin ved tilsætning af 0; 0,1; 0,2; 0,5 og 1,0 ml fortynder til bindevævsceller fra børkroppen, uanset eksponeringstid.

EDTA-sædfortynderen kan altså ved en kontakt til børhalsens slimhindeceller igennem længere tid medføre en stigning i udskillelsen af prostaglandin. Ved traditionel KS vil den EDTA-sædfortyndede sæd passere igennem børhalsen og ind i børkroppen. Dog vil noget af sæddosen forblive i folder i børhalsens slimhinde. Det kan derfor ikke udelukkes, at EDTA-sædfortynderen er medvirkende til den stigning i prostaglandin, som er observeret ved traditionel KS.

Effekt af ekstrakt af sædkateter på celler fra børhals og børkrop

Ekstrakt af sædkateteret (opklippet kateterspids) blev undersøgt med 0, 0,5 og 1,0 ml kateterekstrakt, efter tre timer, tilsat celler fra børhalsen. Alene ved tilsætning af 1,0 ml ekstrakt af sædkateter til børhalsens slimhindeceller sås en stigning i udskillelsen af PGE2. Koncentrationen steg fra 11,4 til 29,9 pg/µg (figur 2). Tilsvarende måling for 24 timers eksponering blev ikke udført. Der sås ingen ændring i udskillelsen af PGF2alfa eller PGFM af tilsætningen i forhold til kontrolgruppen.

Der sås ingen stigning i udskillelsen af prostaglandin ved tilsætning af 0; 0,1; 0,2; 0,5 eller 1,0 ml ekstrakt af sædkateter til bindvævsceller fra børkroppen, uanset eksponeringstid.

      Ekstrakt af sædkateteret kan altså ved en kontakt til børhalsens slimhindeceller i tre timer medføre en stigning i udskillelsen af prostaglandin.

Ved traditionel og dyb KS vil kateterspidsen blive placeret i børhalsen og derfor komme i kontakt med cellerne her. Dog vil kateteret som oftest blive fjernet relativt hurtigt efter placering, som regel efter 4–7 minutter. Det er ikke i dette studie undersøgt om en påvirkning af kateteret i kun fire minutter også giver den observerede stigning i prostaglandin, som set efter tre timers eksponering.

Effekt af sædplasma på celler fra børhals og børkrop

Sædplasma blev undersøgt med 0; 0,1; 0,2; 0,5 og 1,0 ml plasma, efter både tre og 24 timer, tilsat celler fra børhalsen. Ved alle volumina af tilsat sædplasma, både efter tre og 24 timer, og ved begge celletyper fra børhalsen (slimhinde- og bindevævsceller) sås et fald i tilstedeværende prostaglandin ved sammenligning med ingen tilsætning af sædplasma (figur 3 og 4).

Sædplasma besidder altså den egenskab, at det reducerer tilstedeværende prostaglandin ved tilførsel til celler fra både børhalsen og fra børkroppen. Det skal bemærkes, at sædplasma alene er undersøgt som tilsætning til celler fra børhals og børkrop, uden før-tilsætning af hverken EDTA-fortynder eller ekstrakt af kateter.

Ved traditionel KS indeholder en sæddose cirka 10 pct. sædplasma svarende til cirka 8 ml. Da der ved KS er set en stigning i prostaglandinkoncentrationen, og denne må forventes at stamme fra celler i børhalsen og børkroppen, må det konkluderes, at mængden af tilstedeværende sædplasma i en sæddosis ikke er stor nok eller effektiv nok til at hæmme udskillelsen af prostaglandin.

Oversigt over samtlige målinger af prostaglandin, fordelt på celletype tilsat sædfortynder, ekstrakt af sædkateter og sædplasma, er vist i appendiks 1. 

Ved KS er observeret en stigning i blodets indhold af oxytocin såvel som prostaglandin. Begge stoffer påvirker børen til sammentrækning, og dette kan i nogle tilfælde bevirke, at børens muskler kramper. En tilstand af krampe i børens muskler vil kompromittere den passive sædtransport fra børkroppen op til æggelederen, hvor befrugtningen skal finde sted.

For at finde årsagen til den observerede stigning i prostaglandin ved KS er effekten af sædfortynder, kateter og sædplasma undersøgt i et cellestudie, på celler fra børhals og børkrop. Afprøvningen viste, at den anvendte sædfortynder (EDTA-fortynder) efter tilsætning til cellerne i 24 timer forårsagede, at celler fra børhalsen udskilte prostaglandin. Ligeledes udskilte cellerne prostaglandin, når de blev udsat for KS kateterets skumgummi-spids i tre timer. Ved tilsætning af sædplasma til celler fra børhals og børkrop sås i alle tilfælde et fald i tilstedeværende prostaglandin henover tid.

Ud fra ovenstående afprøvning må det konkluderes, at både den i Danmark anvendte sædfortynder og det anvendte sædkateter kan være medvirkende årsag til den observerede udskillelse af prostaglandin, set ved KS. Samtidig er det vist, at sædplasma fra ornens sæd kan hæmme denne udskillelse.   

Der bør planlægges yderligere afprøvninger, hvor en ”naturlig” hæmning af den observerede prostaglandin udskillelse ved KS forsøges minimeret. I første omgang bør den eller de komponenter i sædplasma som forårsager hæmningen i prostaglandin identificeres. Dernæst bør de identificerede komponenter undersøges i et dosis-respons forsøg med stigende mængde prostaglandin. Slutteligt bør der laves en besætningsafprøvning, hvor de fundne komponenter fra sædplasma, i den korrekte koncentration, tilsættes sæddoser og anvendes til inseminering. Effekten af tilsætningen måles på reproduktionsresultaterne, udtrykt som faringsprocent og totalfødte grise pr. kuld.

   
Afprøvning: 879

Målinger af prostaglandin* i picogram pr. mikrogram totalprotein (standard error of the mean)