Undersøgelse af antibiotiske restkoncentrationer

Ved en tidligere undersøgelse af nakkestykker fra 8.810 udbenede slagtesøer blev der fundet bylder og anden vævsskade hos 11 pct. Andelen af søer med nakkeskader varierede på besætningsplan fra 0 pct. til over 50 pct., og de konstaterede skader, som i øvrigt ikke afsløredes ved den rutinemæssige kødkontrolprocedure, var af betydelig størrelse. Nakkeskaderne bestod af bylder, grusagtige korn, bindevævs- og lymfekirtelvækst samt af misfarvninger. Vurderet på besætningsplan tiltog skadernes hyppighed med det antal injektioner, søerne fik pr. faringsomgang. Bylder havde sammenhæng med anvendelse af antibiotika med lang virkningstid. Grusaflejringer havde tæt forbindelse med injektion af ADE-vitamin i olie, med antibiotika med lang virkningstid og med injektion af ormemidlet Ivomec. Sort-/brunfarvning af nakkekødet forekom efter injektion af jernpræparat.

Der fandtes bakteriehæmmende stoffer i 16 af 87 undersøgte vævsprøver med forandring. Ved yderligere undersøgelse blev de bakteriehæmmende stoffer i 6 prøver identificeret som penicillin, i 2 prøver som trimethoprim, i 1 prøve som tetracyklin og i 1 prøve som både penicillin og trimethoprim. I 3 prøver kunne tilstedeværelsen af bakteriehæmmende stof bekræftes, men stoffet blev ikke identificeret, og i 3 prøver kunne det bakteriehæmmende stof ikke genfindes.

Formål

Denne undersøgelses formål var at undersøge om gældende tilbageholdelsestider er tilstrækkelige ved injektioner af antibiotika i nakkemuskulaturen på gylte og søer samt slagtesvin. Undersøgelsen fokuserede på forekomsten af restkoncentrationer på injektionsted og i nyrer. Endvidere blev omfanget af makroskopisk erkendelige skader på injektionsstedet vurderet.

Dyremateriale

Undersøgelserne blev gennemført dels på slagtesvin og dels på ældre søer, der måtte antages at have læsioner i nakkemuskulaturen som følge af tidligere injektioner. Afprøvningen blev gennemført i en besætning, hvor det blev sikret, at slagtesvinene var ubehandlede, og hvor der var registreringer over alle injektioner på den enkelte so. Slagtesvinene var hangrise, sogrise eller galtgrise. De indgik i afprøvningen, når de vejede 90-100 kg, mens søerne indgik i afprøvningen efter fravænning.

Identifikation af dyr

Søerne blev tatoveret med fortløbende numre i nakken i injektionssiden. Slagtesvinene blev tatoveret som søer og mærket med plasticøremærker.

 Præparater og doseringer

Valget af præparater afspejlede dels de antibiotika for hvilke der eksisterer MRL-værdier (Maximum Residue Limit) og dels hvilke midler, der hyppigt anvendes til søer (Tabel 1).

For at simulere den volumen, søer på ca. 200 kg injiceres med, fik slagtesvinene ud over normal dosering også “dobbelt dosis”. For hvert præparat var der to behandlingsmåder: 1 injektion eller 3 injektioner med 24 timers mellemrum. Ved “3 injektioner” blev der ved hver injektion givet samme dosis som ved 1 injektion. Størrelsen af normal dosis var som angivet i Veterinærmedicinsk produktkatalog 1995 udgivet af Veterinærmedicinsk Industriforening. Ved angivelser af et doseringsinterval blev den højeste dosering valgt.

Injektionsted

Injektionsstedet blev afmærket med et tatoveret "0" en håndsbredde bag øret i højde med ørets nederste tilhæftning. Præparaterne blev indsprøjtet dybt i nakkemuskulaturen og injektionen blev udført vinkelret på huden. Til injektionerne blev anvendt en 2,5/3,5 cm lang kanyle til henholdsvis slagtesvin og søer. Ved behandling med 3 injektioner blev det tilstræbt at injicere gennem det samme afmærkede injektionssted alle 3 gange. Ved at give de 3 injektioner på samme sted simulerede man, hvad der i værste fald kan ske under praktiske forhold.

Registrering af effekt

Dagen efter slagtefristens udløb blev dyrene slagtet på Koopmanns Slagteri i Silkeborg. På slagteriet blev begge nyrer og nakkemuskulaturen omkring det tatoverede injektionssted udtaget. Der  blev  udskåret et stykke på ca. 10 cm (længde) x 10 cm (bredde) x 6 cm (dybde). Det udskårne stykke blev gennemskåret, så en eventuel injektionskanal og injektionscentrum blev blotlagt og eventuelle skader blev vurderet med hensyn til omfang og karakter. Alle nakkestykker blev fotograferet.

Laboratorieundersøgelser

På DANSKE SLAGTERIERs laboratorium i Kjellerup blev alle nyrer og muskelprøver screenet for  kvantitativt indhold af væksthæmmende stoffer. De positive prøver blev sendt til Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole eller Slagteriernes Forskningsinstitut til koncentrationsbestemmelse.

Den indledende screening på laboratoriet i Kjellerup blev foretaget ved at måle evt. hæmningszoner omkring vævsprøverne på plader, som blev udsået med en bakteriekultur. Undersøgelsen blev udført efter retningslinjer beskrevet i “Regler for påvisning af restkoncentrationer af antibiotika og kemoterapeutika i slagtedyr” fra Veterinærdirektoratet (J. Nr. K.K. 2930-1986), populært kaldet 4-plademetoden.

Evt. indhold i nyre eller nakkemuskulatur blev vurderet i forhold til MRL værdier (Maximum Residue Limit) for det pågældende præparat. Til MRL bestemmelse blev anvendt hele nyren og ca 500 g muskelvæv uden spæk. Til validering af screeningsmetoden blev der for hvert præparat indsendt mindst 10 stk. nakker og 10 stk. nyrer uden påviseligt indhold af væksthæmmende stoffer.

På Slagteriernes Forskningsinstitut blev der udført koncentrationsbestemmelse på vævsprøver med indhold af penicillin, amoxicillin og ampicillin ved hjælp af HPLC (High Pressure Liquid Chromato-graphy). Vævsprøver blev sendt til Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, for at få bestemt koncentrationene af oxytetracyklin ved hjælp af HPLC. Eventuelt indhold i nyre eller nakkemuskulatur blev vurderet i forhold til MRL-værdier (maximim residue limit) for det pågældende præparat (EU Council Regulation 2377/90, Annex 1).

Vandopløseligt oxytetracyklin

Alle undersøgte vævsprøver var negative ved 4-plademetoden. Ved HPLC-koncentrationsbestemmelsen lå alle de fundne værdier under de af EU fastsatte MRL-værdier på 100 ng/g for muskelvæv og 600 ng/g for nyrer. Endvidere var der god overenstemmelse mellem det injicerede volumen og restkoncentrationerne i vævene. De typiske injektionsskader var brunlig misfarvning, dannelse af lymfoidt væv og diffus blødningi det intermuskulære væv.

Resultaterne er vist i Tabel 4.

HPLC-resultaterne for oxytetracyklin er vist som middelværdi, standardafvigelse samt minimum-maximum værdier, da alle resultater fra Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole er angivet som eksakte værdier.

Vandbaseret benzylpenicillin

Prøver fra nyrer og nakker fra grise, som blev behandlet i tre dage med vandbaseret benzylpenicillin, var alle negative ved 4-plademetoden. Hos grise, der blev behandlet med vandbaseret benzylpenicillin én dag, blev der ved 4-plademetoden fundet tre positive nyrer, som alle havde hæmningszoner, der lå på grænsen for maksimal tilladte hæmningszone. Der var tale om falsk positive, da HPLC- analyserne på nyrer og injektionssted lå under MRL. Ved den kvantitative bestemmelse ved HPLC lå alle værdierne for både nyrer og nakker under kvantifikationsgrænsen, Limit of Quantification (LOQ) på 4,6 ng/g på nær en enkelt nyre, som indeholdt 14 ng/g. Værdierne ligger således langt under MRL-værdien på 50 ng/g væv. Skader efter injektioner var  få, men brunlig misfarvning af bindevævet blev set. Resultaterne er vist i Tabel 5.

Oliebaseret amoxicillin

Ved 4-plademetoden havde 2 undersøgte nakker fra søer hæmningszoner på 3 og 4 mm, hvilket kunne tyde på væksthæmmende stoffer i muskulaturen. Efterfølgende HPLC-analyse af de positive søer plus 8 negative søer viste at indholdet i nakkerne og de tilhørende nyrer alle på nær én lå under detektionsgrænsen, LOD (Limit of Detection) på 22,6 ng/g. En af de indsendte sonyrer havde et indhold, der lå under analysens LOQ på 29,4 ng/g. Der blev ikke påvist væksthæmmende stoffer ved 4-plademetoden i nakkemuskulaturen hos nogen af de injicerede slagtesvin. Ved HPLC-analysen af slagtesvinenakkerne lå de alle under MRL- værdien på 50 ng/g. Én gris, der var blevet behandlet med dobbelt dosis i tre dage havde et indhold på 41 ng/g. Alle de øvrige nakker fra slagtesvinene lå under LOQ og de fleste også under LOD.

Der blev fundet tegn på væksthæmmende stoffer i 10 nyrer - fortrinsvis fra slagtesvin, som havde fået høje doseringer. Ved HPLC-analyse havde alle de undersøgte nyrer værdier, der lå under MRL- værdien på 50 ng/g. Faktisk havde kun én nyre med et indhold på 35 ng/g en værdi, som lå over LOQ. Èn prøve lå under LOQ, mens alle de andre målinger også lå under LOD.

For oliebaseret amoxicillin var følsomheden af HPLC-metoden lav i forhold til MRL-værdien. De prøver, som havde værdier over LOD men under LOQ, var grise, som havde fået præparatet i dobbelt eller 4 x normal dosis. Dette afspejler en sammenhæng mellem injektionsvolumen og restkoncentrationen i vævet. Da de “falsk positive” nyrer var grænsetilfælde eller havde små hæmningszoner på 3-4 mm var der nogenlunde overensstemmelse mellem 4-plademetoden og HPLC-værdierne. De typiske vævsforandringer var 1-2 mm væskefyldte blærer og lymfoidt væv mellem musklerne.Forandringernes størrelse var afhængig af injektionsvolumet. Resultaterne er vist i tabel 6.

Oliebaseret ampicillin

Der blev fundet væksthæmmende stoffer ved 4-plademetoden ved alle doseringer hos både søer og slagtesvin. Antallet af positive prøver hos slagtesvin fordobles omtrent når dosis fordobles. Ved dobbelt dosis øges antallet af positive nakker med 3 ved at injicere tre dage sammenlignet med én dag. I alle analyserede nakker var der god overensstemmelse mellem fund af store hæmningszoner op til 23 mm ved 4-plademetoden og det analyserede indhold, som i alle tilfælde ligger over MRL-værdien på 50 ng/g (laveste værdi 83 ng/g). 88 pct. af alle nakkestykker havde et indhold over 200 ng/g. Det forhold, at der blev fundet flere prøver med forhøjet indhold ved HPLC end ved 4-plademetoden afspejler, at der var usikkerhed i forbindelse med at udpege et vævsstykke med særlig høj koncentration i muskelvævet ved 4-plademetoden. Da to af de tre nakker, som havde MRL- værdier under 50 ng/g (16 og 45 ng/g) var positive ved 4-plademetoden kunne dette tyde på, at plademetodens følsomhed var større end de 50 ng/g som Veterinærdirektoratet angiver. Ved 4-plademetoden var der tre positive nyrer, der lå alle på grænsen af den tilladte hæmningszone. Den efterfølgende koncentrationsbestemmelse ved HPLC viste, at alle værdier for oliebaseret ampicillin i nyre lå  under LOD på 2,6 ng/g. Blandt de øvrige 55 undersøgte nyrer lå kun tre nyrer  over LOQ på 4,6 ng/g (5 ng/g, 14 ng/g og 18 ng/g). Nyrene med indhold over LOD var fra grise, der var blevet behandlet i tre dage. Grisene, som blev injiceret med oliebaseret ampicillin havde de største injektionsskader sammenlignet med de øvrige præparater. De typiske  injektionsskader var pus, grus og grynede aflejringer i udbredte områder i muskulaturen. Udbredelsen var afhængig af injektionsvolumen. Resultaterne er vist i Tabel 7.

For alle de undersøgte præparater dokumenterer HPLC-værdierne at anvendelse af store injektionsvolumener ikke udgør noget problem med hensyn til fund af antibiotika i nyrene (og dermed hele kroppen), da alle værdierne er under de fastsatte MRL-værdier. Anvendelsen af oliebaseret ampicillin i normal dosering til søer og slagtesvin udgør et problem på injektionsstedet, da der på de fleste injektionssteder blev fundet værdier over den tilladte grænse på 50 ng/g muskulatur. For de øvrige præparater er der ikke fundet antibiotika  i mængder, som overstiger de fastsatte MRL-værdier. Da der for oliebaseret ampicillin er fundet flere “positive nakker” ved HPLC end ved 4-plademetoden tyder det på, at 4-plademetoden ikke er en optimal metode til bestemmelse af oliebaseret ampicillin på injektionstedet. Når der ses bort fra oliebaseret ampicillin, som gav restkoncentrationer på injektionstedet, kan det generelt konkluderes, at de gældende tilbageholdelsestider er tilstrækkelige for de undersøgte præparater.

Vandbaseret benzylpenicillin forårsagede færrest skader på injektionsstedet. Vandbaseret oxytetracyklin gav diffus blødning og dannelse af lymfoidt væv i bindevævet. Oliebaseret amoxicillin forårsagede dannelse af større områder af lymfoidt væv i bindevævet. Endvidere lå de fleste forandringer i vævet mellem musklerne. De største skader i form af pus, grus og grynede aflejringer sås efter injektion af oliebaseret ampicillin. For alle præparaterne var der en proportional sammenhæng mellem injektionsvolumen og vævsforandringens størrelse

Faktabox