Undersøgelser over effekten af intrauterin sensibilisering på frugtbarheden hos gylte

Immunologiske mekanismer i reproduktionsprocesserne har i de senere år påkaldt sig betydelig interesse. Forsøg med laboratoriedyr har bl.a. vist, at lokal allogen sensibilisering af uterus hos hunrotter med antigener fra det til parringen benyttede handyr forøgede såvel kuldstørrelse som fostervægt, hvorimod en systemisk immunisering med de samme antigener ikke havde en sådan effekt (Beer og Billingham, 1976). Ved systemisk (subcutan) immunisering af mus med allogene lymfocyter fandt Vorting (1987) derimod, at såvel kuldstørrelse som vægt forøgedes sammenlignet med kontrolgruppen, som var immuniseret med syngene lymfocyter. Ved forsøg med sopolte fandt Skjervold et al. (1979) og Almlid (1981), at intrauterin stimulation af uterus med leukocyter i tilslutning til inseminering forøgede kuldstørrelsen med ca. 11% efter fem ugers drægtighed, sammenlignet med kontrolgruppen. Disse resultater kunne ikke reproduceres af Meding (1983) eller af Blichfeldt (1984), som efter tilsætning af forskellige antigener, bl.a. kvægleukocyter, adjuvantia og mitogener til insemineringsdosis ikke kunne påvise signifikant forøgelse af hverken drægtighedsprocent eller kuldstørrelse hos de inseminerede sopolte.

Medens der i ovennævnte undersøgelser opereredes med en forøgelse af antigeniciteten af selve insemineringsdosis, forsøgte Murray et al. (1983, 1986) og Cheng et al. (1985) at sensibilisere sopolte intrauterint med levende eller dræbte sædceller forud for løbning/inseminering. De fandt i deres undersøgelser en signifikant forbedring af kuldstørrelsen hos de sensibiliserede sopolte. Cheng et al. (1985) viste endvidere, at intrauterin infusion af 50 ml fysiologisk kogsaltopløsning også forbedrede kuldstørrelsen signifikant, men ikke så meget som infusion med dræbte sædceller. De signifikante forbedringer skal vurderes med forbehold, idet kontrolgruppen kun opnåede en gennemsnitlig kuldstørrelse på 6,6 mod 11,2 og 10,0 for henholdsvis infusion med dræbte sædceller og saltvand. Han et al. (1988) opnåede ligeledes en signifikant forbedring af kuldstørrelsen efter sensibilisering af sopolte med sædceller forud for løbning og en mindre, ikke-signifikant forbedring efter sensibilisering med sædplasma, sammenlignet med en ikke-immuniseret kontrolgruppe. Hele materialet omfattede dog kun 37 sopolte. I en lignende undersøgelse omfattende i alt 36 sopolte fandt Erices et al. (1990) derimod ingen signifikant forskel i antal embryoner 23-25 dage efter løbning mellem kontrolgruppen og grupperne sensibiliseret med henholdsvis frosset sæd eller sædplasma fra en vasektomeret orne. Den procentuelle embryonale overlevelsesrate var dog højere i forsøgsgrupperne end i kontrolgrupperne (henholdsvis 83,4%, 88,2% og 75%). Gooneratne og Thacker (1989) fandt i en undersøgelse med intrautering infusion af dræbte sædceller i brunstperioden en signifikant forbedring af drægtighedsprocenten sammenlignet med kontrolgruppen (82% vs 63,3%), men ingen forbedring af kuldstørrelsen. Sluttelig skal nævnes, at i en dansk undersøgelse (Kjeldsen, 1988) fremkom der en tendens til forbedring af kuldstørrelsen på 0,5-0,8 gris ved infusion af dræbte sædceller forud for inseminering.

I de refererede undersøgelser har man benyttet sig af to metoder til at fremkalde en immunreaktion hos hundyret, enten ved en forøgelse af antigeniciteten af selve insemineringsdosis eller ved en forudgående sensibilisering af uterus med et antigen før løbning. I begge tilfælde en behandling, som kan tænkes at ændre dyrenes immunologiske status med deraf følgende indvirkning på frugtbarheden.

En forøgelse af sopoltes frugtbarhed ved manipulation af immunreaktionerne i forbindelse med løbning og drægtighed er ikke uden interesse for svineproduktionen, hvor 25-30% af hundyrene i en sobesætning udgøres af sopolte. Da disse ofte først løbes i deres anden eller tredje brunst af hensyn til opnåelse af optimal kuldstørrelse m.v. ville en præsensibilisering af sopoltene forud for løbning kunne anvendes med fordel uden forsinkelse af gyltenes faringstidspunkt.

Da de hidtidigt opnåede resultater med intrautering antigen stimulering af sopolte synes for usikre og modstridende til, at metoden på nuværende tidspunkt kan tages i brug, blev der på Forskningscenter Foulum foretaget en undersøgelse af effekten af antigen stimulering af uterus forud for løbning.

Sopolte, kuldsøstre, blev i deres første erkendte brunst behandlet på én af følgende måder:

I den følgende brunst 19-24 dage senere blev sopoltene insemineret to gange med 18-24 timers mellemrum og i øvrigt behandlet ens (fodring, opstaldning m.v.). Ca. seks uger efter inseminering blev dyrene slagtet, og antallet af gule legemer og fostre samt disses vægt registreret.

De til infusionen anvendte sædceller, som stammede fra andre orner end de, der blev benyttet til inseminering, blev behandlet på følgende måde: Efter opsamling, filtrering og koncentrationsbestemmelse centrifugeredes sæden 2000 omdr./min. i 10 minutter. Supernatanten fjernedes og sædcellerne resuspenderedes i EDTA-sædfortyndingsvæske tilsat 2% glycerol og 1 mg neomycinsulfat/ml, fordeltes i enkeltdoser indeholdende ca. 8 x 10⁹ sædceller pr. 10 ml, og blev derefter opbevaret ved ÷20 °C indtil brugen. Umiddelbart før infusion i uterus blev en dosis optøet og overført til 50 ml EDTA-sædfortyndingsvæske.

Lymfocyterne til infusionen blev behandlet på følgende måde:

EDTA-stabiliseret fuldblod fra svin tilsattes en 6% dextranopløsning til "fældning" af erytrocyterne. Efter 45 minutters henstand afpipetteredes supernatanten med lymfocyterne, anbragtes på Lymfoprep og centrifugeredes 2500 omdr./min. i 25 minutter, hvorefter lymfocylaget afpippeteredes og overførtes til glas med Hanks opløsning. Efter tilsætning af NH₄Cl og inkubering v. 37 grader celsius i 7 minutter, centrifugeredes der 2000 omdr./min. i 10 minutter. Supernatanten fjernedes, og lymfocyterne blev vasket to gang i Hanks opløsning. De vaskede lymfocyter fordeltes herefter på enkeltdoser á 100-200 x 10⁶ lymfocyter i 10 ml Hanks opløsning og blev opbevaret ved 5 °C indtil brugen. (Maks. opbevaringstid: 7 dage). Umiddelbart før infusion i uterus opslemmedes en lymfocytdosis i 50 ml EDTA-sædfortyndingsvæske.

BSA-L blev fremstillet på følgende måde:

500 mg BSA opløstes i 50 ml 0,9% natriumkloridopløsning, hvorefter der tilsattes 50 ml alhydrogel (Aluminium Hydroxyd Gel) som adjuvans. Blanding i 12-24 timer. Opbevaring ved 5 °C indtil brugen. (Max. 7 dage). Umiddelbart før infusionen overførtes 20 ml af BSA-L til 40 ml EDTA-sædfortyndingsvæske.

EDTA-sædfortyndingsvæsken havde følgende sammensætning:

Forsøget blev opgjort ved hjælp af maksimum likelihood metoden, og der blev i den statistiske model korrigeret for blok, orne samt antal gule legemer.

I tabel 1 er vist de opnåede resultater efter præsensibilisering med dræbte sædceller, BSA-L, lymfocyter og EDTA-sædfortyndingsvæske, samt for et kontrolhold. Det ses, at antallet af gule legemer har været næsten ens for de forskellige hold, varierende fra 14,0 til 14,9. Derimod har antallet af implanterede fostre udvist en variation fra 11,9 til 9,8 hvilket har resulteret i en variation i overlevelsesraten fra 79,9 til 68,1% for holdene sensibiliseret med henholdsvis BSA og lymfocyter. Ingen af de fundne forskelle er imidlertid signifikante. Der kunne ikke påvises signifikante forskelle i fostrenes gennemsnitsvægt mellem de forskellige behandlinger efter korrektion til samme alder.

I tabel 2 er vist estimerede behandlingsgennemsnit for en gennemsnitsorne og en gennemsnitsso med 14 gule legemer. Det ses, at det primært er efter immunisering med lymfocyter, der forekommer en afvigende overlevelsesrate, men de konstaterede forskelle mellem grupperne er som omtalt ikke signifikante.

Den foreliggende undersøgelse har ikke kunnet dokumentere en signifikant forbedring af frugtbarheden efter intrauterin sensibilisering af sopolte forud for løbning (Tabel 1). Efter korrektion for antal gule legemer og de anvendte orner og søer er de fundne forskelle heller ikke signifikante (Tabel 2). Der er dog en tendens til en forbedring af frugtbarheden efter sensibiliseringerne. Således er der efter behandling med dræbte sædceller konstateret 0,6 flere implanterede fostre/kuld sammenlignet med kontrolholdet.

Den bemærkelsesværdigt lave overlevelsesrate efter sensibilisering med lymfocyter er i modstrid med tidligere lignende undersøgelser hos svin (Skjervold et al. 1979; Almid, 1981). En forklaring kan være, at lymfocyterne i de norske undersøgelser blev tilsat selve insemi­neringsdosis.

Lymfocyter brugt til svin, som i den foreliggende undersøgelse, er ikke tidligere rapporteret. Det er en kendsgerning, at forskellige antigener også har forskellig immuniserende effekt afhængig af forskellig forhold. Kan antigenet f.eks. ikke optages gennem slimhinden til de immunogene områder, vil den antigene effekt være væsentligt ændret. Dette forhold kunne være en del af forklaringen på, at sensibilisering med lymfocyter havde en noget afvigende effekt. Tilsyneladende er den sensibiliserende effekt af lymfocyter størst, hvis de sættes direkte til insemineringsdosis (Skjervold et al. 1979; Almlid 1981), men ud fra et praktisk synspunkt vil det imidlertid være nemmere at anvende andre antigener end lymfocyter til denne insemineringsmåde.

Mange undersøgelser har efterhånden peget på, at en eller anden form for modulering af immunapparatet er nødvendig for, at moderdyret rent immunologisk kan acceptere em­bryonerne og en drægtighed gennemføres, uden at fostrene afstødes ved en immunreaktion (Beer og Billingham, 1976). Om den forbedrede frugtbarhed, som af og til ses efter immuniseringer, direkte skyldes immunologiske forhold, eller også skal tilskrives en forbedring af fostrenes uterine miljø, er der ikke nogen entydig forklaring på endnu. I flere undersøgelser på mus er der f.eks. rapporteret om en øget placentavægt efter præsensibiliseringer, som kunne skuldes en sekundær immunologisk effekt, men også kunne være resultatet af en almindelig mekanisk påvirkning af uterus (Beer og Billingham, 1976). Dette kunne måske være forklaringen på, at gyltene, som kun blev sensibiliseret med EDTA-sædfortyndingsvæske i denne undersøgelse, også udviste en svag forbedring af frugtbarheden sammenlignet med kontrolholdet. En mulig forbedring i fostrenes forsyning med næringsstoffer efter de forskellige immuniseringer har imidlertid ikke medført signifikante forskelle i fostrenes vægt, således som det er fundet i undersøgelser med mindre forsøgsdyr (Beer og Billingham, 1976).

Resultaterne har således ikke bekræftet, at intrauterin sensibilisering kan medføre øget kuldstørrelse. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse grundlaget for anvendelsen af denne behandlingsteknik.

I den foreliggende undersøgelse har intrauterin infusion af sopolte forud for løbning med dræbte sædceller, BSA-L, lymfocyter eller fortyndingsvæske ikke signifikant kunnet forbedre frugtbarheden.

Anerkendelser

Forsøgsleder, lic. agro. Erik Jørgensen takkes for udførelse af de statistiske analyser. Undersøgelsen er udført med økonomisk støtte fra KS-fonden, Danske Slagterier.

Almlid, T., 1981. Does enchanced antigenicity of semen increase the litter size in pigs? Z. Tierzüchtg. Züchtgsbiol. 98, 1-10.

Beer, A.E. & Billingham, R.E. 1976. The immunobiology of mammalian reproduction. Prentice Halle Inc., Englewood Cliffs, New York. pp 240.

Blichfeldt, T. 1984. Effect of addition of antigen, adjuvant or mitogen to semen on embryonic survival in artificially inseminated gilts. Z. Tierzüchtg. Züchtgsbiol. 101, 298-304.

Cheng, S.P., Hsia, L.C., & Ji, L. W. 1985. The effect of intrauterine infusion of gilts with saline or semen before insemination on reproductive performance. J. Chinese Soc. Anim. Sci. 1-2, 63-66.

Erices, J., König, M. und Schulz, J. 1990. Zur Sensibilisierung der Gebärmutter bei Jungsauen vor ihrer Zuchtbenutzung mit Seminalplasma oder abgetötetem Sperma von Ebern (Kurzmitteilung). Mh. Vet.-Med. 45, 762-763.

Goonerante, A.D. & Thacker, P.A. 1989. Effect of intrauterine infusion of sperm antigens on gilt fertility. Therogenology. 6, 1221-1226.

Han, K. Y., Kim, C. K., Yoon, J. T., Kim, H. T., Chung, V. C., Seo, K. D., Youn, Y. W. & Lee, Y. M. 1988. A study on increase of litter size by intrauterine infusion on semen antigens before breeding in gilts. Korean J. Anim. Sci. 30, 532-541.

Kjeldsen, N. 1988. Personlig meddelelse.

Melding, J.H., 1983 Befrugtningseffektiviteten af ornesæd tilsat hvide blodlegemer (leukocyter) som antigen. medd. nr. 497, Statens Husdyrbrugsforsøg.

Murray, F. A., Grifo, A. P. Jr. & Parker, G. F., 1983. Ingreased litter size in gilts by intrauterine infusion of seminal and sperm antigens before breeding, J. Anim. Sci. 56, 895-900.

Murray, F. A., & Grifo, A. P. 1986. Intrauterine infusion of killed semen to increase litter size in gilts, J. Anim. Sci. 62, 187-190.

Skjervold, H., Almlid., T., Onstad, O. & Fossum, K, 1979. Envidence of immunological influence on the number of live embryos in pigs. Z. Tierzüchtg. Züchtgsbiol. 96, 235-236.

Vorting, M. 1987. Betydningen af immunreaktioner i uterus for soens reproduktion. Licentia­tafhandling. Den kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, København pp. 50.